Межвидовое и внутривидовое разнообразие картофеля по устойчивости к Y-вирусу

В научном наследии Н.И. Вавилова значительное место занимают работы, посвященные вопросам иммунитета культурных растений. Рассматривая отношения «широкого круга растительных объектов» к различным инфекционным заболеваниям, он отмечал, что «природа вирусов, как инфекционных начал имеет весьма существенные особенности, которые отличают их от обычных паразитов» (1). Вирусология как научная дисциплина в 1930-е годы находилась в самом начале развития. Вирус табачной мозаики, то есть новый тип фитопатогенов, был обнаружен в конце XIX столетия (2), вызывающие наиболее заметные поражения на растениях картофеля вирус скручивания листьев и Y-вирус (YBK) — в начале XX столетия (3, 4).

Наблюдения за мировой коллекцией в опытной географической сети ВИР (Всероссийский НИИ растениеводства) и анализ работ зарубежных исследователей стали основой для статьи Н.И. Вавилова «Иммунитет растений к вирусным заболеваниям» (1937). В этой работе обращается внимание на широкую распространенность вирусных болезней среди вегетативно размножаемых (в том числе клубнеплодных) культур, географические закономерности в степени поражаемости растений и зависимость симптомов вирусных заболеваний от внешних условий. Н.И. Вавилов указывал, что самая характерная особенность вирозов с точки зрения иммунитета — «отсутствие для многих вирусов какой-либо связи филогении растений-хозяев и их реакции на поражение вирусом», в отличие от закономерностей, установленных в отношении паразитических грибов. В цитируемой выше работе Н.И. Вавилов отмечает трудность «поддержания в живом виде огромного разнообразия диких и культурных видов картофеля, собранных в Кордильерах, из-за поражаемости различными вирусными заболеваниями», восприимчивость к вирусам самых отдаленных филогенетических форм и видов картофеля, неустойчивость большинства сортов картофеля к наиболее распространенным вирусам мозаичности (1).

Из всех мозаичных вирусов наиболее серьезный ущерб культуре картофеля наносит Y-вирус, из-за поражения которым в годы эпифитотий снижение урожая может достигать 80 % (5-7).

Продолжая изучение коллекции ВИР в отношении устойчивости к YBK, мы исследовали меж- и внутривидовое разнообразие культурного и дикого картофеля с использованием фитопатологических и молекулярногенетических методов.

Методика. Материалом для исследования послужили образцы ди- ких и культурных видов картофеля из коллекции ВИР, относящиеся к североамериканской группе (серии Demissa, Pinnatisecta, Longipedicellata) и к южноамериканской группе (серии Tuberosa, Maglia, Acaulia, Megistacroloba). Всего было изучено 416 коллекционных образцов, в том числе 309 образцов культурных видов: Solanum ajanhurii — 8, S. chaucha — 27, S. cu-rtilobum — 10, S. juzepczukii — 13, S. phureja — 44, S. stenotomum — 74, S. tuberosum subsp. tuberosum — 38 и S. tuberosum subsp. andigenum — 95, а также 107 образцов диких видов: S. acaule — 12, S. albicans — 1, S. brevicaule — 5, S. bukasovii — 2, S. canasense — 1, S. demissum — 8, S. gourlayi — 12, S. ho-ndelmannii — 7, S. leptophyes — 4, S. maglia — 3, S. megistacrolobum — 2, S. mu-ltidissectum — 7, S. oplocense — 5, S. pinnatisectum — 6, S. sparsipilum — 7, S. spegazzinii — 13, S. stoloniferum — 8, S. tarnii — 1 и S. vernei — 3. Названия серий и видов указаны по системе Дж. Хокса (J. Hawkes, 1990). Материал был представлен отдельными генотипами-клонами (3-5 растений каждого генотипа) или сеянцами (20-30 растений на образец).

Вирусоустойчивость определяли в полевых условиях на высоком инфекционном фоне для всех образцов выборки. Образцы, не пораженные YBK в полевых условиях, оценивались методами искусственного заражения (при механической инокуляции и прививке) (8). Результаты оценивали визуально по симптомам поражения и методом иммуноферментного анализа (ELISA-тест) с применением диагностических наборов (фирма «Agdia Inc.», США). Источниками инфекции для штаммов Y^OBK и Y N BK служили растения картофеля соответственно сортов Детскосельский и Wilga (IHAR — The Plant Breeding and Acclimatization Institute, Radzik o w, Польша). Предварительно инфекционность используемых изолятов проверяли на тест-растениях Nicotiana tabacum (сорт Samsun). Клоновые растения испытывали в 2-кратной повторности, заражая от 1 до 8 побегов (по 3 инокулированных листа на каждом побеге). Растения, не поразившиеся при механической инокуляции, были заражены повторно с помощью прививки на инфицированные растения табака или томата.

Молекулярный скрининг выполняли с применением маркеров, разработанных для MAS (marker-assisted selection — маркер-вспомогательный отбор) сортообразцов картофеля, устойчивых к YBK. Эти маркеры сцеплены с генами, контролирующими крайнюю устойчивость к Y-вирусу: CAPS-маркер GP122/EcoRV-406 гена Ry-f_sto (12-я хромосома) (9, 10) и SCAR-маркер RYSC3-320 гена Ry_adg (11-я) (13, 14). Режим ПЦР, а также условия рестрикции соответствовали рекомендациям разработчиков праймеров (10-12). Продукты амплификации и рестрикции разделяли электрофорезом в горизонтальных 1,6 % агарозных гелях в буфере ТВЕ с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией в УФ-свете.

Результаты . В условиях высокого инфекционного фона у растений культурного и дикого картофеля были выявлены меж- и внутривидовые различия по пораженности вирусом (табл. 1). Отмечалось большое распространение Y-вируса среди изученных образцов культурных видов картофеля, особенно полиплоидных (89-93 % пораженных образцов) по сравнению с диплоидными S . phureja и S . stenotomum (соответственно 23 и 50 %). У диких видов картофеля также выявили значительное число образцов, пораженных YBK: среди южноамериканских видов из комплекса brevicaule — 26 %, из серии Acaulia — 67 %, а также у филогенетически отдаленных североамериканских видов из серий Longipedicellata и Pinnatisecta — соответственно 37 и 67 % (табл. 1).

Среди изученных образцов разных видов были выявлены формы с неодинаковым типом — резистентные к инфицированию (или с полевой устойчивостью), толерантные к инфекции, со сверхчувствительной реакцией

1. Результаты фитопатологического и молекулярного скрининга образцов культурных и диких видов картофеля (род Solanum L.) из коллекции Всероссийского НИИ растениеводства (ВИР) на зараженность Y-вирусом (УВК)

Число изученных образцов

Серия, вид	всего	проверенных в ELI-SA/пораженных УВК (%)	c диагностическим фрагмен-том/из них пораженных УВК
			RУSC3-320 С	Г P122-EcoRV-406
В ид Серия Tuberosa : S. chaucha	ы из 27	Южной Америки Êóëüòóðíûå 14/13 (93)              0		14/5
S. curtilobum	10	10/9 (90)	0	0
S. phureja	44	31/7 (23)	0	0
S. stenotomum	74	55/25 (50)	0	7/0
S. tuberosum subsp . andigenum	95	95/85 (89)	2/0	6/2
S. tuberosum subsp . tuberosum	38	38/35 (92)	0	0
Серия Tuberosa : комплекс S. brevicaule ( S. bukasovii , ' S. canasense , S. gourlayi , S. hon-delmannii , S. leptophyes , S. multidis-	> 66	Дикие 35/9 (26)	0	12/0
sectum , S. oplocense , S. sparsipilum , S. spegazzinii , S. vernei ) Серия Acaulia : S. acaule	12	12/8 (67)	0	0
Виды Серия Demissa : S. demisssum	из Северной Америки Дикие 8            —              6/—			0
Серия Longipedicellata : S. stoloniferum	8	8/3 (37)	5/0	3/0
Серия Pinnatisecta : S. pinnatisectum	6	6/4 (67)	6/4	0

Примечание. Для ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay — иммуноферментный анализ) отбирали растения без явных симптомов вирусного поражения; приведены результаты изучения видов, представленных пятью и более образцами. Прочерки означают, что материал не изучали.

и иммунные (то есть с крайней степенью устойчивости). У южноамериканских культурных видов ( S . phureja , S . stenotomum , S . tuberosum subsp. andigenum , S . tuberosum subsp . tuberosum , S . curtilobum ) и диких видов ( S . bre-vicaule , S . bukasovii , S . gourlayi , S . hondelmannii , S . leptophyes , S . multidissec-tum , S . sparsipilum , S . spegazzinii , S . albicans , S . acaule ) с разной частотой обнаруживались генотипы с полевой устойчивостью. Часть устойчивых к УВК в полевых условиях генотипов культурных диплоидных видов S . phureja , S. stenotomum не поражались и при механической инокуляции. Среди диких видов североамериканской группы были генотипы с полевой устойчивостью (образцы S . stoloniferum и S . pinnatisectum ), сверхчувствительные к У-вирусу картофеля (образцы S. stoloniferum ), иммунные (образцы S. pinnati-sectum , S. tarnii и S. stoloniferum ).

Результаты фитопатологической оценки сопоставили с данными молекулярного скрининга (см. табл. 1; рис., А, Б). Из всего изученного межи внутривидового разнообразия южноамериканских видов диагностический фрагмент RУSC3-320 был выявлен только у двух образцов (к-1742, к15826) андийского тетраплоидного культурного картофеля ( S . tuberosum subsp. andigenum ) и среди образцов всех изученных североамериканских видов ( S . pinnatisectum , S . tarnii , S . stoloniferum , S . demissum ). Диагностический фрагмент GP122-EcoRV-406 детектировали у ряда генотипов культурных видов S . stenotomum, S . chaucha , S . tuberosum subsp. andigenum , южноамериканских диких видов комплекса brevicaule , S . megistacrolobum и у мексиканского вида S . stoloniferum (см. табл. 1).

Сравнение результатов молекулярного скрининга (наличие/отсут-ствие диагностического компонента) с данными фитопатологического ана- лиза не дает однозначного ответа на вопрос об эффективности использованных маркеров (см. табл. 1).

А

Б

Электрофоретические спектры продуктов ПЦР-амплификации маркеров, сцепленных с генами, контролирующими крайнюю устойчивость к Y-вирусу у видообразцов картофеля из коллекции Всероссийского НИИ растениеводства (ВИР) : А — SCAR-маркер RYSC3-320 гена Ry_adg , Б — CAPS-маркер GP122/EcoRV-406 гена Ry-f sto ; 1 — S . tuberosum subsp . andigenum (к-4500), 2 — S . tarnii (GLKS), 3 — S . chaucha (к-24688), 4 — S . demissum (к-23321), 5 — S . chaucha (к24678), 6 — S . phureja (к-22218), 7 — S . phureja (к-2221), 8 — S . curtilobum (к-13698), 9 — S . phureja (к-22199), 10 — S . phureja (к-21569), 11 — S . phureja (к-5962), 12 — S . stoloniferum (к3326), 13 — S . chaucha (к-24688), 14 — S . chaucha (к-24684), 15 — S . chaucha (к-24683), 16 — S . stenotomum (к-11023), 17 — S . stenotomum (к-11026), 18 — S . brevicaule (к-5663); M — маркер молекулярных масс GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder UAB «Fermentas», Литва.

2. Характеристика видов Solanum stoloniferum и S . pinnatisectum из коллекции Всероссийского НИИ растениеводства (ВИР) по реакции на заражение Y-вирусом картофеля (YBK) и наличию маркеров R -генов устойчивости

№ по каталогу ВИР	Число изученных генотипов	Реакция на YBK	Число генотипов с наличием/отсутствием (+/ - ) диагностических фрагментов
			RYSC3-320		GP122-EcoRV-406
			+       1	-	+	-
		S . stoloniferum
к-3326	2	Иммунитет	2	0	2	0
к-3360	7	Иммунитет	7	0	3	4
к-3533	4	Иммунитет	4	0	4	0
к-3554	4	Иммунитет	3	1	0	4
к-21616	2	Иммунитет	2	0	0	2
Всего	19		18	1	9	10
		S . pinnatisectum
к-4455	4	Иммунитет	2	2	0	4
к-4459	11	Иммунитет	11	0	0	11
	1	Восприимчивость	1	0	0	1
к-15254	1	Полевая устойчивость	1	0	0	1
	5	Восприимчивость	5	0	0	5
к-19157 }	3	Иммунитет	3	0	0	3
	5	Восприимчивость	5	0	0	5
к-21955	11	Иммунитет	10	1	0	11
к-23569	5	Иммунитет	4	1	0	5
	2	Восприимчивость	1	1	0	2
Всего	48		43	5	0	48

Следует отметить, что оба ДНК-маркера сцеплены с R -генами, контролирующими крайнюю устойчивость (иммунитет к YBK) у растений картофеля. Поскольку иммунные формы были выявлены только среди образцов мексиканских видов S . stoloniferum и S . pinnatisectum , материал изучили более подробно. По результатам 2-кратного испытания (искусственное заражение методом механической инокуляции и прививки на инфицированный табак) обнаружили 19 иммунных к YBK генотипов среди образцов к-3326, к-3360, к-3533, к-3554, к-21616 вида S . stoloniferum (табл. 2). Из 48 изученных генотипов вида S . pinnatisectum , относящихся к образцам к-4455, к-4459, к-19157, к-21955, к-23569, один проявлял полевую устойчивость, 13 были восприимчивыми к YBK и 34 — иммунными. Охарактеризованные по устойчивости генотипы исследовали на наличие диагностических компонентов RYSC3-320 и GP122-EcoRV-406 (см. табл. 2).

Маркерный фрагмент RYSC3-320 детектировался у 18 из 19 генотипов S . stoloniferum , обладающих иммунитетом к Y-вирусу, и у 30 из 34 иммунных к Y-вирусу генотипов S . pinnatisectum (см. табл. 2). Диагностический компонент маркера GP122-EcoRV-406 обнаружили у 9 из 19 иммунных к Y-вирусу генотипов S . stoloniferum и не отмечали ни у одного из 34 иммунных к Y-вирусу генотипов S . pinnatisectum (см. табл. 2).

Таким образом, при изучении вирусоустойчивости у образцов культурных видов картофеля и их диких родичей из южноамериканского центра происхождения, а также у филогенетически отдаленных видов из североамериканского центра происхождения, различающихся уровнем (ди-, три-, тетра-, пента-, гексаплоиды) и типом (авто- и аллополиплоиды) плоидно-сти, геномным составом (А- и В-геномные виды), а также системами размножения (самоопылители и перекрестноопыляемые формы) мы отмечали меж- и внутривидовую изменчивость по устойчивости к Y-вирусу, а также различия в реакциях растений культурных и диких видов на вирусную инфекцию. Результаты изучения генофонда картофеля указывают на отсутствие связи между устойчивостью растений к Y-вирусу и таксономической принадлежностью, геномным составом, а также географической приуроченностью исследованного материала. Данные, полученные нами при скрининге широкого разнообразия диких и культурных видов картофеля, подтверждают справедливость точки зрения Н.И. Вавилова (1) о «редкостности» нахождения иммунных к вирусной инфекции форм картофеля и специфических особенностях иммунитета растений к вирусным заболеваниям.

В литературе имеются сведения об эффективности использования MAS-маркеров RYSC3 (13-15) и GP122 (16). Однако в этих исследованиях указанные маркеры были использованы для скрининга конкретных расщепляющихся популяций и не привлекались для изучения видового разнообразия коллекций. Наши результаты показывают, что маркеры, разработанные ранее для маркер-вспомогательного отбора сортообразцов картофеля, оказались недостаточно эффективными при скрининге широкого видового разнообразия . Например, диагностический фрагмент RYSC3-320 был выявлен у устойчивых к YBK образцов S . tuberosum subsp . andigenum , подавляющего большинства иммунных генотипов S . stoloniferum , но обнаружен как у иммунных, так и у восприимчивых генотипов S . pinnatisectum . Диагностический фрагмент GP122 тоже обнаружили лишь у половины устойчивых генотипов вида S . stoloniferum и в то же время — у нескольких восприимчивых к вирусу YBK генотипов культурных видов S . chaucha и S . tuberosum subsp . andigenum . Подобные факты можно объяснить либо рекомбинацией в участках хромосом, где локализованы гены, контролирующие иммунитет к YBK, и соответствующие маркеры, либо наличием у этих видов иных, чем Ry_adg (11-я хромосома) и Ry-f_sto (12-я хромосома), генов, контролирующих крайнюю устойчивость к YBK, о которых сообщают некоторые исследователи (17, 18).

Итак, фитопатологическими и молекулярно-генетическими методами у культурных и диких видов картофеля выявлена меж- и внутривидовая изменчивость по устойчивости к Y-вирусу, а также разнообразие ответных реакций растений на вирусную инфекцию. Важным практическим результатом работы стало создание признаковой коллекции генотипов, охарактеризованных по устойчивости к Y-вирусу и наличию ассоциированных с генами устойчивости Ry-f_s to и Ry adg маркеров GP122-EcoRV-406 и RYSC3-320, которая служит источником форм, ценных для селекции картофеля.