Оценка внеклеточного и внутриклеточного протеолиза при предопухолевых и опухолевых заболеваниях гортани

Рак гортани (РГ) продолжает занимать лидирующие позиции среди злокачественных опухолей верхних дыхательных путей, составляя 65–70 %. В общей структуре онкологической заболеваемости на РГ приходится 1,4 %. В 2012 г. в России зарегистрирован 6 601 первичный случай рака гортани. Несмотря на доступность органа для визуального и инструментального исследования, эта опухоль по-прежнему редко выявляется на ранних стадиях. На долю РГ I стадии пришлось 10,6 % впервые выявленных случаев заболевания, тогда как распространенный процесс – рак гортани III и IV стадий – был выявлен у 46,8 % и 17 % больных соответственно [9].

Эпидемиологические исследования, проведенные в различных странах, показали, что практически в 60 % случаев РГ развивается на основе различных хронических заболеваний, составляющих группу облигатного предрака: хронический гиперпластический ларингит (ХГЛ) и папилломатоз гортани (ПГ), дискератоз [8, 12]. Частота ХГЛ в популяции варьирует в пределах 30–65 %, а вероятность малигнизации данного заболевания в сроки от 6 мес до 7 лет с момента установки диагноза составляет 60–65 %. При папилломатозе злокачественное перерождение возможно у 8–20 % больных, обычно оно реализуется в течение 10 и более лет [1, 7].

В настоящее время наличия очагов дисплазии в эпителии гортани недостаточно для включения пациента в группу онкологического риска, поскольку неоднородность диспластических изменений внутри подгруппы не позволяет адекватно определить сроки динамического наблюдения и методы лечения – необходимы дополнительные более определенные критерии прогноза развития предраковых изменений [22]. В литературе активно обсуждается возможность использования определения матриксных металлопротеаз (ММП), которые являются внеклеточными протеазами и участвуют практически во всех этапах опухолевой прогрессии [2, 4, 11, 14, 15]. Показана важность определения ММП и их тканевых ингибиторов в качестве потенциальных прогностических маркеров [3, 17, 21]. Кроме того, в развитии плоскоклеточного рака области головы и шеи важную роль играют внутриклеточные протеазы, такие как протеасомы и кальпаины [9, 10, 13, 16]. Однако отсутствуют публикации о роли ММП, протеасом и кальпаинов при злокачественной трансформации в слизистой оболочке гортани, а также о практическом использовании их определения для выявления больных с диспластическими процессами с высоким онкологическим риском по РГ.

В связи с этим целью исследования было изучение экспрессии генов матриксных металлопротеиназ, активности протеасом и кальпаинов при предопухолевых и опухолевых заболеваниях гортани.

Материал и методы

В работе представлены результаты исследования 51 больного раком гортани (стадии T1–4N0–3M0) в возрасте от 31 до 77 лет и 12 человек с предопу-холевыми заболеваниями гортани (ХГЛ и папилломатоз) в возрасте от 38 до 69 лет, находившихся на обследовании и лечении в ФГБУ «НИИ онкологии» г. Томска. Исследование проходило с разрешения локального этического комитета института, было получено информированное согласие пациентов. Группы больных были сопоставимы по полу, возрасту и сопутствующим заболеваниям. Во всех случаях опухоли имели гистологическое строение плоскоклеточного рака различной степени диффе- ренцировки. Все больных раком гортани до начала исследования не получали специального лечения.

При выполнении видеоларингоскопии проводился забор материала из участков опухоли и неизмененной слизистой оболочки на расстоянии примерно 2 см от границы опухоли для комплексного морфологического исследования с целью верификации диагноза и для исследования экспрессии генов ММП, химотрипсинподобной активности протеасом и активности кальпаинов. Для подтверждения отсутствия патологических изменений в данных участках выполнялись мазки-отпечатки. У пациентов с предопухолевыми заболеваниями забор материала осуществлялся из измененных участков, а также из нормальной слизистой на расстоянии примерно 2 см от патологического процесса. Биопсийный материал замораживали в жидком азоте, перевозили и хранили при температуре -80°С.

Выделение суммарной клеточной РНК проводили с помощью набора Illustra RNAspin Mini Kit (GE Healthcare). Затем РНК очищали от примеси ДНК с помощью ДНКазы. Для оценки качества суммарную клеточную РНК анализировали электрофорезом в 1,5 % агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидия бромида. Качество и количество РНК оценивали на спектрофотометре NanoDrop 1000, соотношение A260/А280 составляло не менее 1,8–2,0.

Для получения кДНК проводили реакцию обратной транскрипции РНК в присутствии 0,5 мкг универсального праймера oligo(dT)16 и M-MuLV обратной транскриптазы (Биосан, Новосибирск). Для контроля прохождения реакции обратной транскрипции с полученным продуктом и нере-вертированной РНК проводили ПЦР с праймерами, специфичными к последовательности гена GAPDH.

Для анализа уровня экспрессии генов ММП-1, -2, -9, -14 использовали метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (РВ-ПЦР) с праймерами производства фирмы Sintol (Москва) [6]. Реакционная смесь для проведения ПЦР-реакции содержала дНТФ 2,5 мМ, 10хПЦР-буфер, MgCl2, 25 мМ, смесь праймеров 10 пкмоль/мкл, флуоресцентный зонд 10 пкмоль/мкл, Tag-ДНК-полимеразу 5 Е/мкл, образец кДНК, деионизированную воду. Реакцию проводили на амплификаторе Rotor-gene 6000 (Австралия). Результаты выражали в услов- ных единицах (уровень экспрессии изучаемых генов по отношению к уровню экспрессии гена домашнего хозяйства). В качестве эндогенного внутреннего контроля, относительно которого проводили нормализацию продуктов амплификации исследуемых генов, был выбран ген «домашнего хозяйства» GAPDH. Изменение уровня количества мРНК в образце опухолевой ткани по отношению к неизмененной ткани вычисляли по формуле: 2-ΔΔCt [18].

Определение химотрипсинподобной активности протеасом и активности кальпаинов проводили в осветленных гомогенатах, для чего замороженную ткань (100 мг) гомогенизировали в жидком азоте, затем ресуспендировали в 300 мкл 50 мМ трис-HCl буфера (pH=7,5), содержащего 2 мМ АТФ, 5 мМ хлорида магния, 1 мМ дитиотреитола, 1 мМ ЭДТА и 100 мМ хлорида натрия. Гомогенат центрифугировали 60 мин при 10 000g и 4°С. Химотрипсин-подобную активность протеасом определяли по гидролизу флуорогенного олигопептида N-Suc-cinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-Amido-4-Methylcoumarin (Sigma, США), утилизирующегося химотрипсин-подобными центрами протеасом, на флуориметре Hitachi-850 (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм (Ben-Shahar S., 1999). Для оценки активности примесных протеаз в образцах применяли специфический ингибитор протеа-сом – MG132. За единицу активности протеасом принимали количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин. Удельную активность протеасом выражали в единицах активности на 1 мг белка. Содержание белка определяли по методу Лоури.

Активность кальпаинов определяли в осветленных гомогенатах тканей по гидролизу флуороген-ного олигопептида Suc-LLVY-AMC [19]. Реакцию проводили, добавляя к 30 μМ Suc-LLVY-AMC (Sigma, США), растворенному в реакционной смеси, 5 μl супернатанта и инкубируя при 25°С в течение 30 мин в присутствии или отсутствии 10 мМ CaCl2 и 50 μМ ингибитора N-ацетил-Leu-Leu-норлейцинала (Sigma, США). Образовавшийся продукт регистрировали на флуориметре Hitachi-850 (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. Активность кальпаинов определяли в пробах с 10 мМ CaCl2 и с ингибитором. За единицу активности принимали количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин. Удельную активность выражали в единицах активности на 1 мг белка. Содержание белка определяли по методу Лоури.

Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета статистических программ Statistica 6.0. В зависимости от вида распределения результаты представлены как m±M, где m – среднее выборочное, M – ошибка среднего, или как медиана с интерквартильным размахом (25-й и 75-й процентили). Значимость различий исследовали с помощью t-критерия Стьюдента или критерия Манна – Уитни.

Результаты исследования

Изучение экспрессии генов матриксных металлопротеиназ ММП-1, -2, -9, -14 в тканях злокачественных новообразований и диспластически измененного эпителия гортани показало, что исследуемые показатели определялись во всех образцах. При статистической обработке результатов было обнаружено, что уровни экспрессии исследуемых генов в опухолевой и неизмененной ткани не различались, что, по-видимому, может говорить об увеличении деструктивного потенциала опухоли. Ранее было показано, что клетки карциномы экспрессируют индуктор экстраклеточных матриксных металлопротеиназ EMMPRIN, который, находясь на цитоплазматической мембране опухолевых клеток, может увеличивать продукцию ММП-2 и ММП-9 клетками микроокружения [5]. Возможно, такое влияние опухоли распространяется и на окружающую неизмененную ткань.

Сравнительный анализ результатов ПЦР-РВ генов ММП-1, -2, -9 и -14 в ткани диспластически измененного эпителия и рака гортани показал наличие различий в их экспрессии (табл. 1). В группах с диспластическими изменениями эпителия и раком гортани Т1N0М0 стадии показаны значимые различия в экспрессии генов ММП-1, ММП-2 и ММП-14 (табл. 1).

Экспрессия гена ММП-1 (р=0,016) была почти в 3 раза выше в опухолевой ткани у больных РГ Т1N0М0 стадии, по сравнению с тканями больных с диспластическими изменениями эпителия, и сохраняла тенденцию к росту с увеличением размера первичного опухолевого очага. Значительно возрастал уровень экспрессии ММП-14 в тканях опухоли у пациентов РГ T1N0M0стадии (р=0,007) по сравнению с группой пациентов с диспластически измененным эпителием – разница составила 45%.

Далее уровень экспрессии ММП-14 возрастал с увеличением размера опухолевого узла. Экспрессия гена ММП-2 была выше в диспластически измененных тканях по сравнению с тканью рака гортани Т1N0М0 стадии; с увеличением стадии заболевания наблюдалось возрастание показателя.

Обсуждение

Высокие значения экспрессии генов ММП-1 и ММП-14 на ранних стадиях рака гортани, возможно, указывают на важную роль этих показателей в инициации и развитии злокачественного процесса, что согласуется с литературными данными [14, 15, 17, 20, 21]. Патогенез злокачественных заболеваний тесным образом связан не только с усилением внеклеточного протеолиза, но и с изменением состояния системы деградации белков внутри клетки. Протеасомы являются основным компонентом этой системы, играя важную роль в процессах расщепления собственных белков клетки, и опосредуют процессы клеточного деления, дифференцировки, иммунного ответа и др. Результаты исследования химотрипсинподобной активности протеасом в опухолевой, диспластической и неизмененной ткани гортани представлены в табл. 2. В группе больных раком гортани активность протеасом в опухоли была достоверно выше по сравнению с таковой в диспла-стической ткани. Также наблюдалось увеличение активности кальпаинов в ткани опухоли по сравнению с диспластической тканью. Выявленный факт позволяет сделать вывод об активации внутриклеточного протеолиза в ткани рака гортани как за счет протеасом, так и за счет кальпаинов. Стоит отметить, что функция последних в канцерогенезе плоскоклеточного рака до сих пор полностью не ясна.

Таблица 1

Сравнительная экспрессия генов матриксных металлопротеиназ в опухолевой ткани

и в диспластически измененном эпителии гортани

Показатели, у.е.	Диспластические процессы гортани	Опухолевая ткань Т1N0М0	Опухолевая ткань Т2–4N1–3М0	р
ММП-1	0,6 ± 0,37 n=8	1,76 ± 0,69 n=18	1,82 ± 0,597 n=10	р1=0,016 р2=0,05
ММП-2	1,64 ± 0,63 n=8	1,37 ± 0,15 n=21	1,65 ± 0,77 n=30	р1=0,03 р2=0,05
ММП-9	0,78 ± 0,21 n=8	1,57 ± 0,02 n=16	1,82 ± 0,24 n=11	р1= 0,3 р2=0,03
ММП-14	0,84 ± 0,21 n=11	1,22 ± 0,2 n=21	1,65 ± 0,09 n=30	р1=0,007 р2=0,002
GAPDH	2,09 ± 0,23 n=10	1,78 ± 0,49 n=20	1,86 ± 0,22 n=29	р1=0,07 р2=0,08

Примечание. р1– значимость различий между опухолевой тканью стадии Т2–4N1–3М0 и диспластическими процессами гортани, р2 – значимость различий между опухолевой тканью стадии Т1N0М0 и диспластическими процессами гортани; n – количество пациентов в группе.

Таблица 2

Тотальная активность протеасом и кальпаинов в диспластически измененной и опухолевой тканях гортани

Вид ткани	n	Тотальная активность протеасом, 103 Ед/мг белка	n	Общая активность кальпаинов, 103 Ед/мг белка
Диспластически измененный эпителий	10	43,3 (31,5–56,4)	10	28,6 (13,5–39,4)
Опухолевая ткань	23	59,8 (37,2–120,0)*	10	125,7 (67,0–256,0)*

Примечание. * – различия статистически значимы по сравнению с диспластически измененным эпителием (р<0,05); n – количество пациентов в группе.

СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2014. № 3

Увеличение активности протеасом в ткани РГ по сравнению с гиперпластическими процессами, вероятно, связано со значительным повышением интенсивности клеточных процессов, многие участники которых являются субстратами протеа-сом: белки-регуляторы клеточного цикла, многие транскрипционные факторы, белки pRb и p53, ингибитор NF-κB IκB, белки, контролирующие активность каспаз, компоненты сигнальных путей [16]. Соответственно, происходит и усиление аппарата деградации белков. Полученные результаты, свидетельствующие о значительном повышении активности кальпаинов в опухолевой ткани по сравнению с гиперпластической, согласуются с данными N.O. Carragher et al. (2004) о повышении активности кальпаинов при трансформации клеток в клеточных культурах и позволяют сделать вывод о преимущественном участии кальпаинов в процессах, свойственных только злокачественным тканям [13].

Заключение

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что внеклеточные и внутриклеточные протеазы играют важную роль в развитии рака гортани. Показана целесообразность дальнейших исследований показателей протеолиза в тканях диспластически измененного эпителия и РГ с целью разработки показателей, важных для обнаружения заболевания на ранних стадиях рака данной локализации. Выявленные особенности патогенеза диспластических процессов и РГ в будущем помогут выделить дополнительные объективные критерии, которые позволят адекватно оценить онкологический риск и прогнозировать у больных развитие злокачественного новообразования.