Содержание гликоалкалоидов и состав белков в листьях картофеля при повреждении колорадским жуком

Основным защитным механизмом при формировании устойчивости растений картофеля к поражению клубней моллюсками, личинками насекомых и паразитическими червями является образование эндогенных аллелохимических соединений — вторичных продуктов метаболизма (терпеноиды, флавоноиды, фенолы, гликоалкалоиды, небелковые аминокислоты, хиноны, гликозиды, гликозинолаты и др.), оказывающих токсическое действие и тормозящих рост и развитие вредителей (1, 2).

Наиболее ощутимый вред посадкам картофеля наносят насекомые-листоеды и прежде всего колорадский жук (что особенно актуально для Европы и России). Факторы, обусловливающие устойчивость растений к листогрызущим насекомым, многообразны: механическая защита листовой пластинки (опушенность и др.), им-мунохимические реакции, накопление в тканях листа разнообразных защитных белков (дефензины, ингибиторы протеиназ, растительные токсины) и фитотоксинов небелковой природы (аллелохимические вещества), существенно снижающих питательную ценность зеленой массы для насекомых-листоедов (3).

Токсические свойства, которыми обладают гликоалкалоиды в отношении насекомых, признаются сейчас очень многими авторами. В специальных исследованиях установлено, что гликоалкалоиды картофеля способны ингибировать ацетилхолинэ-стеразу, что существенно затрудняет проведение нервного импульса и блокирует координирующую деятельность центральной нервной системы, в том числе и у насекомых (4). На суспензионных культурах эритроцитов кролика, клеток корня свеклы и протопластов Penicillium notatum Westling показано, что гликоалкалоиды существенно изменяют проницаемость клеточных мембран, а в определенной концентрации вызывают лизис клеток (5). Следует отметить, что для колорадского жука и насекомых вообще поступление с пищей некоторых чужеродных стероидов просто необходимо для создания собственных клеточных элементов из-за неспособности синтезировать стериды и, в частности, холестерин самостоятельно (6). Однако включение в этот процесс стероидных гликоалкалоидов может иметь нежелательные и даже фатальные последствия для метаболизма насекомых.

В задачу нашей работы входило определение содержания и качественного состава защитных белков и небелковых соединений, в частности гликоалкалоидов, в листьях растений разных видов, сортов картофеля и дикорастущих сородичей при повреждении колорадским жуком.

Методика . Объектом исследования служили следующие виды картофеля: Solanum commersonii Dun., S. demissum Lindl., S. spegazzini Bitt., S. polyadenium Greenm., S. andigenum Juz. et Buk. (ssp. argentinicum и ssp. colombianum ), S. goniocalyx

Juz. et Buk. и S. tuberosum L. (сорта Вятка, Елизавета, Жуковский, Зарево, Луговской, Невский, Петербургский, Темп).^* В качестве грунта использовали верхний слой тщательно просеянной почвы хвойного леса, которую помещали в деревянные ящики; плотность посадки составляла одно растение на 1-2 дм². Образцы картофеля культивировали при ежедневном искусственном поливе.

Имаго колорадского жука первого «летнего» поколения, проходящего нажиров-ку, собирали в полевых условиях на посадках картофеля (Смоленская обл., Гагаринский р-н). Для того чтобы избежать нежелательного проявления полиморфизма природных популяций колорадского жука и соответствующих им особенностей пищевой специализации, мы старались отбирать жуков, полностью идентичных по рисунку переднеспинки (7).

Особей колорадского жука с одинаковым «фенообликом» подсаживали по 10 шт. на листья четырех-пяти верхних ярусов отдельных растений картофеля. Во избежание свободного перемещения жуков их помещали в садки из тонкой капроновой сетки, укрепленные у основания листьев. Удаляли жуков с растения после того, как они уничтожали приблизительно 1/3 часть всей площади листовой пластинки (обычно через 16-20 ч). В тушках жуков определяли содержание адреналина по методу Ронина (8), модифицированному для работы с личинками и имаго насекомых (9); в срезанных частях листьев (сразу же после удаления жуков, а также через 1, 3 и 5 сут) — содержание гликоалкалоидов по методу Тукало (10) и качественный состав белков методом ДДС-Na-электрофореза (0,1 % додецилсульфат натрия) в полиакриламидном геле по Лэммли (11) с окрашиванием белковых фракций кумасси R-250.

Для оценки специфичности повреждений сравнивали результаты биохимического анализа листьев индивидуальных растений, поврежденных жуками, имеющими разные фенотипы (I опыт), и листьев, механически поврежденных (II опыт) посредством постепенного надрезания края листа ножницами на протяжении I опыта. Контролем служили, во-первых, неповрежденные листья индивидуальных растений, участвовавших в I и II опытах (контроль 1), во-вторых, — листья с неповрежденного растения (контроль 2). Для чистоты эксперимента на всех листьях в контроле и II опыте укрепляли капроновые садки без жуков.

Статистическую обработку данных проводили по t -критерию Стьюдента.

Результаты . Наиболее высоким содержанием гликоалкалоидов (600 мг/100 г сырой массы и более) характеризовались дикорастущие виды картофеля S. polyadenium , S. demissum и S. goniocalyx (табл. 1). У большинства сортов S. tuberosum (за исключением Зарево и Вятка) содержание гликоалкалоидов было почти в 4 раза ниже — не более 150 мг/100 г сырой массы. Содержание гликоалкалоидов в листьях растений подвидов S. andigenum , а также дикорастущих видов S. commersonii и S. spegazzini составляло в среднем около 450 мг/100 г сырой массы.

1. Содержание гликоалкалоидов в листьях интактных и пораженных колорадским жуком растений картофеля разных видов, подвидов и сортов в зависимости от продолжительности повреждающего воздействия (мг/100 г сырой массы)

Вид, подвид, сорт

I опыт (листья, поврежденные имаго     Контроль 1 (интактные листья с поврежден-ных     II опыт (механически по-    Контроль 2 (интактные колорадского жука)                    колорадским жуком растений)                     врежденные листья)        растения) В р е м я в з я т и я п р о б ы, сут 1-е            3-и            5-е                  3-и           1              5-е              1               5-е

Solanum andigenum: ssp. argentinicum ssp. colombianum S. commersonii S. demissum S. goniocalyx S. polyadenium S. spegazzini S. tuberosum , сорт: Вятка Елизавета Жуковский Зарево Луговской Невский Петербургский Темп

483 ± 21         503 ± 17         516 ± 14              476 ± 15                      521 ± 18                            –                            477 ± 18 496 ± 15         516 ± 13         519 ± 17                 –                            –                            471 ± 16                          475 ± 16 511 ± 17         506 ± 18           –                 523 ± 17                      511 ± 15                          486 ± 16                          505 ± 17 597 ± 14        618 ± 19        639 ± 20                –                       630 ± 17                        576 ± 18                        612 ± 20 –             –             –                  –                          –                          578 ± 18                        600 ± 19 625 ± 19        631 ± 19        652 ± 20                –                       641 ± 21                        654 ± 24                        638 ± 22 –          512 ± 18           –                489 ± 16                       –                             –                          515 ± 16 225 ± 7,9        231 ± 6,9        216 ± 8,0                 –                         208 ± 6,7                         198 ± 5,9                         212 ± 7,4 128 ± 5,2         120 ± 3,6         127 ± 4,0                  –                           117 ± 3,8                           121 ± 5,3                            121 ± 4,0 –            153 ± 5,3         144 ± 4,7                  –                           135 ± 4,3                            140 ± 4,1                            147 ± 5,3 308 ± 9,2        347 ± 11         364 ± 10              324 ± 10                      366 ± 11                          296 ± 9,8                         311 ± 9,3 130 ± 7,5        137 ± 4,3        148 ± 4,4              134 ± 4,0                      145 ± 4,4                         121 ± 3,9                         124 ± 4,0 113 ± 4,0        110 ± 2,8        120 ± 5,4                 –                         124 ± 3,4                         115 ± 3,6                         112 ± 3,9 140 ± 4,5         153 ± 4,2         162 ± 4,8               133 ± 4,2                        158 ± 4,6                           140 ± 4,2                           138 ± 4,1 128 ± 4,5         135 ± 4,0         142 ± 5,3               130 ± 4,0                        137 ± 3,1                            108 ± 5,6                           121 ± 4,6

П р и м е ч а н и е. Прочерк означает отсутствие данных. Описание вариантов опыта см. в разделе «Методика».

2. Содержание адреналина у имаго колорадского жука, питавшегося на листьях разных видов, подвидов и сортов картофеля (мг%)

Вид, подвид, сорт	Содержание адреналина
Solanum andigenum:
ssp. argentinicum	7,54 ± 0,24
ssp. colombianum	7,48 ± 0,23
S. commersonii	11,60 ± 0,40
S. demissum	14,90 ± 0,50
S. goniocalyx	13,80 ± 0,40
S. polyadenium	15,80 ± 0,50
S. spegazzini	7,21 ± 0,23
S. tuberosum, сорт:
Вятка	4,18 ± 0,11
Елизавета	3,16 ± 0,09
Жуковский	3,28 ± 0,10
Зарево	4,84 ± 0,16
Луговской	3,15 ± 0,10
Невский	3,12 ± 0,08
Петербургский	3,24 ± 0,03
Темп	3,41 ± 0,10

Известно, что у насекомых адреналин выделяется в гемолимфу из corpus cardiacum в состоянии стресса (например отравление ДДТ), оказывая определенный физиологический эффект на нервную систему, чем способствует смене гиперактивности на состояние прострации. В то же время адреналин насекомых участвует в регуляции углеводного обмена, контролируя распад гликогена в мышцах, а также концентрацию свободной трегалозы в гемолимфе (6).

Основываясь на этих данных, следует полагать, что наименее пригодными для питания колорадского жука, а значит, и наиболее устойчивыми к нему оказались представители видов S. polya-denium, S. demissum и S. goniocalyx, а наименее устойчивыми — все исследованные сорта S. tuberosum, за исключением сорта Зарево (табл. 2). Питание листьями растений сорта Зарево вызывало у колорадских жуков увеличение содержания адреналина (55 %) в значительно большей степени, чем у тако- вых, заселявших другие сорта картофеля. В листьях растений этого сорта выявлено также высокое содержание гликоалкалоидов (311 мг/100 г сырой массы). Доказательством

взаимосвязи между содержанием в листьях гликоалкалоидов и интенсивностью выделения адреналина у колорадских жуков может служить высокая устойчивость сорта Зарево к последним.

Тесная положительная корреляция между содержанием гликоалкалоидов в листьях растений картофеля и содержанием адреналина у имаго колорадского жука ( r = 0,92) выявлена и для других образцов картофеля, включая дикорастущие виды и примитивный культурный вид S. andigenum (рис. 1).

Рис. 1. График корреляционной зависимости между содержанием адреналина у имаго колорадского жука и количеством гликоалкалоидов в листьях картофеля: 1 — экспонента (линия тренда), 2 — отрезки экспоненциальной зависимости, близкие к прямолинейным.

Следовательно, гликоалкалоиды листьев картофеля обеспечивают защиту растений от повреждения колорадским жуком. Поскольку при увеличении содержания гликоалкалоидов в листьях количество адреналина у колорадского жука возрастает, этот признак можно использовать в качестве критерия оценки устойчивости растений к листогрызущим насекомым.

Исследование динамики содержания гликоалкалои- дов при повреждении листьев некоторых образцов культурного картофеля позволило нам получить еще одно экспериментальное подтверждение непре- менного участия этих соединений в формировании устойчи вости растений к насекомым-листоедам. У ряда исследованных сортов (Зарево, Лу-говской, Петербургский, Темп) отмечено прогрессирующее увеличение содержания гликоалкалоидов, наблюдаемое иногда уже через 24 ч после подсаживания жука, а через 5 сут оно достигало 17-18 % от первоначального уровня (рис. 2).

Рис. 2. Содержание гликоалкалоидов в листьях различных сортов картофеля ( Solanum tuberosum ) после повреждающего воздействия колорадского жука в течение 1 (I), 3 (II) и 5 (III) сут: а — сорт Зарево; б — сорта Петербургский (1), Луговской (2) и Темп (3); К — контроль (содержание гликоалкалоидов в интактном растении).

Следует отметить, что накопление гликоалкалоидов в поврежденных колорадским жуком листьях картофеля можно было зарегистрировать, используя в качестве контроля (норма) только полностью интактные растения (контроль 2). В неповрежденных листьях растений, заселенных жуком (контроль 1), содержание гликоалкалоидов так же, как и в I опыте, не оставалось постоянным, а возрастало по ходу эксперимента практически синхронно (см. табл. 1). Вместе с тем механическое повреждение, имитировавшее погрызы жука (II опыт), не оказывало влияния на содержание гликоалкалоидов.

Итак, на примере сортов картофеля Зарево, Луговской, Петербургский и Темп показано, что гликоалкалоиды могут служить не только конституционным, но и факультативным (динамическим) защитным фактором, который активируется в состоянии стресса растения и к тому же специфичен в отношении характера нанесенного повреждения. По всей видимости, индуктором образования гликоалкалоидов в клетках листьев является не просто их механическое повреждение, которое само по себе встречается весьма редко, а какое-то биологически активное вещество, выделяемое колорадским жуком при питании и, вероят нее всего, являющееся обычным компонентом слюны насекомого. Нам пока не известно, каким именно образом слюна колорадского жука может индуцировать выде- ление стероидных гликоалкалоидов при повреждении листьев, однако механизм регуляции содержания этих метаболитов в растении можно представить вполне определенно. В частности, известно, что биосинтез стеролов и изопреноидов в основном лимитируется действием ключевого метаболита — мевалоновой кислоты — и находится под контролем 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-редуктазы (ГМГР, КФ 1.1.1.34). Сравнительно недавно было показано, что регуляция активности этого фермента происходит на уровне транскрипции, так как мРНК образуется только в ответ на повреждение клеток, стресс (например закисление межклеточного пространства или фарнезол-индуцированная гибель клеток в суспензионной культуре Nicotiana tabacum L.) или здесь действуют какие-либо «сигнальные» факторы, осуществляющие внешнюю регуляцию метаболизма (например свет при синтезе пигмента шиконина у Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc.) (12, 13). У картофеля ГМГР кодируется целым семейством генов, индукция экспрессии которых происходит строго дифференцированно в зависимости от того, каким фактором она была вызвана — фитопатогеном, повреждением тканей листа или обработкой элиситором (арахидоновая кислота) (14).

Вполне возможно, что и в нашем случае какие-то компоненты, выделяемые слюнными железами насекомого, индуцировали специфическую экспрессию одного из множества изоферментов ГМГР, который катализировал образование мевалоновой кислоты, служащей источником углерода при биосинтезе стероидной группы гликоалкалоидов, что способствовало повышению содержания последних в клетке. При этом надо полагать, что у растений в этой цепочке должен присутствовать как минимум еще один «фактор», осуществляющий информационную связь между поврежденными и интактными тканями. Распространение этого «фактора» должно осуществляться посредством как ближнего (внутри листа), так и дальнего транспорта (между отдельными листьями), так как только это могло быть причиной почти синхронного увеличения содержания гликоалкалоидов как в поврежденных, так и в интактных листьях, расположенных на том же поврежденном растении (контроль 1).

При анализе качественного состава и электрофоретических спектров белков из листьев интактных и поврежденных растений картофеля нами установлено, что у всех образцов, характеризовавшихся увеличением содержания гликоалкалоидов в ответ на повреждение, уже через 1 сут после начала эксперимента появлялась новая фракция белков, молекулярная масса которых составляла около 93 кД (рис. 3). Такое сходство молекулярной массы вновь образованного белка у всех исследованых образцов картофеля, в том числе и дикорастущих видов, позволяет сделать предположение о структурной гомологии этого белка и, возможно, общем характере механизма формирования устойчивости, по крайней мере, для представителей рода Solanum .

Рис. 3. Электрофореграмма денатурированных белков из листьев растений различных видов и сортов картофеля при повреждении колорадским жуком (10 % ПААГ, 0,1 % додецилсульфата натрия) : 1 — Sola-num andigenum ssp. argentinicun ; 2 — S. andigenum ssp. colombianum ; 3 — S. commersonii ; 4 — S. demissum ; 5 — S. goniocalyx ; 6 — S. spegazzini ; 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14 — S. tuberosum соответственно сорта Вятка, Елизавета, Жуковский, Зарево, Луговской, Невский, Петербургский и Темп; М — маркер молекулярной массы, К — контроль (интактные растения), 1 и 3 — повреждающее воздействие в течение соответственно 1 и 3 сут.

Сопоставив данные об изменении содержания гликоалкалоидов и качественного состава белков, можно предположить, что белком, синтезированным de novo в листьях поврежденных растений, как раз и является ГМГР, лимитирующая синтез гликоалкалоидов на стадии образования мевалоновой кислоты. Еще одним косвенным подтверждением этого предположения является сообщение Choi с соавт. о дифференциальной активации двух картированных ГМГР-генов ( hmg -1 и hmg -2) S. tuberosum в зависимости от внешних условий, причем повреждение растения индуцировало образование только hmg -1-транскриптов (15). Длина hmg -1-тран-скрипта, по данным тех же авторов, составляет приблизительно 2,5 тыс. пар нуклеотидов. Нетрудно подсчитать, что молекулярная масса белкового продукта, синтезируемого на мРНК такой длины, должна составлять как раз около 90 кД.

Далее у всех без исключения экспериментальных образцов картофеля отмечено образование одного-двух, а чаще сразу нескольких низкомолекулярных белков — от 15 до 24 кД. В целом белки этой группы отличались от белка с молекулярной массой 93 кД значительно большим разнообразием, но вместе с тем у них наблюдается определенная видоспецифичность. У отдельных сортов S. tuberosum белки с молекулярной массой 15-24 кД были более или менее однородными (см. рис. 3). Вполне возможно, что эти белки являются оксипролин- и пролинбогатыми гликопротеинами (ПБГП), физиологическая роль которых до конца еще не выяснена. Предполагают, что ПБГП представляют собой, с одной стороны, специфические агглютинины, синтезируемые в ответ на чужеродный белок, а с другой — являются компонентами кле- точных мембран, принимающих участие в регуляции проницаемости и хеморецепции клеток (16).

Таким образом, повреждение растений картофеля (род Solanum ) колорадским жуком индуцирует синтез гликоалкалоидов и вызывает прогрессирующее увеличение их концентрации во всех листьях; механическое повреждение листьев не отражается на содержании гликоалкалоидов. Показано, что содержание адреналина у колорадского жука тесно коррелирует с содержанием гликоалкалоидов в поврежденных листьях. У всех исследованных образцов картофеля, которые характеризовались высоким содержанием гликоалкалоидов в листьях при повреждении растений колорадским жуком, происходит образование de novo высокомолекулярного белка (93 кД), а также целого ряда низкомолекулярных белков (15-24 кД). По нашему мнению, выделение гликоалкалоидов в листьях и кожуре клубней поврежденных колорадским жуком растений картофеля служит одним из факторов системной индуцированной устойчивости последних к листогрызущим насекомым, специфическим в отношении характера наносимого повреждения. Содержание гликоалкалоидов в листьях картофеля, а также содержание адреналина у имаго колорадского жука, заселяющего последние, могут служить критерием оценки устойчивости образцов различных видов и сортов картофеля к листогрызущим насекомым.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.   К е ф е л и В.И. Природные ингибиторы роста. Физиол. раст., 1997, 44, 3: 471-480.

• 2.   П а с е ш н и ч е н к о В.А. Регуляция терпеноидного биосинтеза в растениях и его связь с биосинте

  зом фенольных соединений. Физиол. раст., 1995, 42, 5: 787-804.

• 3.    В и л к о в а Н.А., Г у с е в а Н.Н. Проблемы иммунитета растений к вредителям и болезням. Вест. РАСХН, 1994, 6: 11-13.

• 4.    B u s h w a y R.J., S a v a g e S.A., F e r g u s o n B.S. Inhibition of acetyl cholinesterase by solanaceous glycoalkaloids and alkaloids. Amer. Potato J., 1987, 64, 8: 409-413.

• 5.    R o d d i c k J.G., R i j n e n b e r g A.L., O s m a n S.F. Synergistic interaction between potato glycoalkaloids α α -solanine and α α -chaconine in relation to destabilisation of cell membranes: ecological implication. J. Chem. Ecol., 1988, 14, 3: 889-902.

• 6.   С в и д е р с к и й В.А. Основы нейрофизиологии насекомых. М., 1986.

• 7.   Ф а с у л а т и С.Р. Анализ структуры популяций колорадского жука и его значение для разработки

  зональных систем защиты картофеля. Бюл. ВИЗР. СПб, 1987, 63: 38-43.

• 8.    Р о н и н Б.С., С т а р о б и н е ц Г.М. Руководство к практическим занятиям по методикам клинических лабораторных исследований. М., 1989.

• 9.    Методические рекомендации по изучению и оценке форм картофеля на устойчивость к колорадскому жуку /Под ред. Н.А. Вилковой. М., 1993.

• 10.    Т у к а л о Е.А., Ц а р и к Г.Н. Ускоренный метод количественного определения гликоалкалоидов картофеля. Науч. докл. высшей школы (сер. Биологические науки), 1970, 12: 115-117.

• 11.    L a e m m l i U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature, 1970, 227, 5259: 680-685.

• 12.    H a m m e r l i n A., B a c h T.J. Farnesol-induced cell death and stimulation of 3-hydroxy-3-methylglutaril-coenzyme A reductase activity in tobacco cv Bright Yellow-2 cells 1,2. Plant Physiol., 2000, 123, 8: 1257-1268.

• 13.    L a n g e M.B., S e v e r i n K., B e c h t h o l d A. e.a. Regulatory role of microsomal 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase for shikonin biosynthesis in Lithospermum erythrorhizon cell suspension cultures. Planta, 1998, 204, 2: 234-241.

• 14.    Y a n g Z., P a r k H., L a c y G.H. e.a. Differential activation of potato 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase genes by wounding and pathogen challenge. Plant Cell, 1991, 3, 8: 397-405.

• 15.    C h o i D., B o s t o c k R., A v d i u s h k o S. e.a. Lipid-derived signals that discriminate wound- and pathogen-responsive isoprenoid pathways in plants: Methyl jasmonate and the fungal elisitor arachidonic acid induce different 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase genes and antimicrobial isoprenoids in Solanum tuberosum L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 3: 2329-2333.

• 16.    Л о м о в а Л.А. Исследование экспрессии генов защитных белков в клубнях картофеля при ответе на стресс и после обработки индукторами устойчивости. Автореф. канд. дис. Новосибирск, 1995.

Московский педагогический государственный университет , 129278, Москва, ул. Кибальчича, 6