Beta-sitosterin: properties, approaches to quantitative analysis

Фитостерины (фитостеролы) являются биологически активными компонентами всех продуктов растительного происхождения [1].

Первый фитостерин был описан Ф. Бенеке в 1862 году. Бенеке обнаружил стероидное соединение в горохе, но из-за несовершенных аналитических методик того времени ошибочно предположил, что это был холестерол. Потребовалось более 50 лет, пока было установлено, что соединение, которое открыл Бенеке, на самом деле являлось бета-ситостерином. В 1897 году Г.Томс установил, что все стерины растительного происхождения относятся к фитостеринам [2].

В растениях эти вещества существуют как в виде свободных соединений, так и в виде конъюгатов [3]. Свободная гидрокси группа у C3 атома углерода дает возможность свободным фитостеринам взаимодействовать с фосфолипидами и белками в клеточных мембранах [4].

Известно, что в природе существует более 200 фитостеринов, самым распространенным среди них является бета-ситостерин. Бета-ситостерин структурно подобен холестерину. Сравнение формул холестерина и бета-си-тостерина представлены на рисунке 1.

Гипохолестеринемическое действие фитостеринов известно на протяжении многих лет. В 1980 году японским ученым удалось выделить насыщенные формы фитостеринов, известные как фитостанолы, показавшие более сильную способность понижать уровень холестерина в крови [5].

В начале 1990 годов была описана этерификация стеринов, что значительно увеличило возможность включать фитостерины в состав пищевых продуктов. Первые коммерческие продукты, содержащие этерифицирован-ные станолы, были выпущены в 1995 году в Финляндии под торговой маркой Бенекол. Позже во всем мире стали выпускать множество продуктов, обогащенных фитостеринами и фитостанолами. Среди них: йогурты, энергетические батончики, молоко, майонез и др. Финляндия до сих пор является страной, выпускающей наибольшее количество продуктов, обогащенных фитостеринами и фитостанолами [6].

Фитостерины считаются безопасными биологическими добавками (GRAS – Generally Recognized As Safe). Главным противопоказанием для употребления фитостеринов является болезнь «фитостеролемия», генетическое заболевание, связанное с мутациями белка-переносчика ABCG5/G8, который играет важную роль в поступлении стеринов в энтероциты и гепатоциты.

Источники бета-ситостерина

Бета-ситостерин выделяют различными хроматографическими методами из разнообразных растительных семейств. Больше всего бета-ситостерин содержат растения семейств: бобовые, липовые, пасленовые, волчниковые, крушиновые, гречишные и т.д.

Бета-ситостерин содержится в больших количествах в таких продуктах как: рис, зародыши пшеницы, семечки тыквы, орехи, соя и др.

Бета-ситостерин содержится в растениях: эхинацея бледная (Echinaceapallida), эхинацея пурпурная (Echinaceapurpurea), слива африканская (PrunusAfricana) и пальма ползучая (Serenoarepens), которые входят в состав европейской фармакопеи [7].

На данный момент источником для промышленного получения фитостеринов является растение соя культурная (GlycineMax). Семена сои содержат большое количество различных растительных фитостеринов:

стигмастерин (около 20%), бета-ситостерин (около 50%), кампестерин (около 20%). В семени сои 40% бета-ситостерина содержится в свободной форме, а остальное в форме гликозидов или сложных эфиров с жирными кислотами. Масло обычно экстрагируют из высушенных семян гексаном.

Бета-ситостерин получают этерификацией с жирными кислотами из сои, для получения липофильного продукта.

Бета-ситостерин используют для лечения хронического простатита, так в настоящее время в России зарегистрировано несколько препаратов на основе экстракта плодов пальмы ползучей, таких как: Пермиксон (Пьер Фабр, Франция), Простамол-Уно (Берлин-Хеми, Германия), Простагут моно (Доктор ВилльмарШвабе, Германия), Простаплант (Доктор Вилльмар Швабе, Германия), Серпенс (Лизафарма, Италия), Палпростес (СвиссКэпс, Швейцария). Основным действующим веществом пальмы ползучей является бета-ситостерин .

Также бета-ситостерин входит в состав многих биологически активных добавок: Проста-Стронг (IrwinNaturals США), Овесол (Эвалар, Россия), Бетуланорм (Березовый мир, Россия), Гепалексин (Байфлор, Россиия), Фитопростан (HANKINTATUKU Финляндия) и др.

Фармакологические свойства

Бета-ситостерин обладает различными фармакологическими действиями: гипохолестеринемическим, снижает риск возникновения рака толстой кишки, простаты, молочной железы, желудка, легких, влияет на состояние иммунной системы и патологические воспалительные реакции.

Следует знать, что свободные фитостерины имеют низкую биодоступность, а благодаря этерификации, т.е. образованию эфиров фитостеринов и высших жирных кислот, этот недостаток удается устранить, и повысить их функциональность.

В пятнадцати рандомизированных плацебо-кон-тролируемых исследованиях в разных странах, а также в крупномасштабных программах в Дании, Финляндии и США было установлено, что при дозе 2 г в день (рекомендовано U.S. National Cholesterol Education Program) фитостерины устойчиво снижают уровень общего холестерина у взрослых и детей на 9,6–11,3%, ЛПНП – на 10%, при этом не влияют на уровень липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) и триглицеридов [8], действие их не зависит от приема статинов [9].

Механизм гипохолестеринемического действия фитостеринов изучен не до конца [10]. Однако, имеющиеся в настоящее время данные показывают, что фитостерины подавляют всасывание холестерина в тонкой кишке [11]. Предполагается, что из-за дополнительных метильной и этильной групп в фитостеринах их гидрофобность выше, чем у холестерина. Повышение гидрофобности увеличивает сродство к мицеллам, тем самым замещая холестерин [12]. Молекулы фитостеринов блокируют проникновение

«вредного холестерина» за счет уменьшения его включения в мицеллы с желчными кислотами. Всасывание холестерина в кишечнике снижается на 30–50%.

Так же фитостерины обладают онкопрофилактиче-ской активностью. Механизм онкопрофилактического действия этих веществ связан с их влиянием на структуру клеточных мембран и регуляцию клеточных сигналов, способностью тормозить опухолевый рост и вызывать самопроизвольную гибель раковых клеток, а также стимулировать реакции противоопухолевого клеточного иммунитета (активность клеток-киллеров). В различных исследования было продемонстрировано, что дополнительное включение в рацион питания фитостеринов ингибировало рост раковых клеток.

Одним из уникальных свойств фитостеринов является их способность влиять на состояние иммунной системы и патологические воспалительные реакции. Исследования показали, что под их воздействием восстанавливается уровень и соотношение Th1- и Th2-лим-фоцитов (повышается образование иммуноактивных Th1-цитокинов и снижается уровень противовоспалительных Th2-цитокинов), значительно усиливается ответ Т-лимфоцитов на митогены, активизируются клетки-киллеры по отношению к раковым клеткам.

Было установлено, что фитостерины в высоких концентрациях способны подавлять секрецию противовоспалительных цитокинов, уровень которых повышается при таких заболеваниях, как астма, ревматоидный артрит, красная волчанка, других аутоиммунных заболеваниях, а также при физических перегрузках. Торможение продукции противовоспалительных эйкозаноидов (простагландинов) служит основным механизмом снижения воспаления и аллергии при действии фитостеринов, сравнимый с действием аспирина, индометацина и даже кортизона [12].

Химические свойства

Формально фитостерины (фитостеролы) можно отнести к производным тетрациклических тритерпенов, но они составляют особую группу соединений, входящих в состав стероидов. Все стероиды имеют в молекуле циклическую структуру циклопентанпергидрофенантрена. У фитостеринов этот углеродный скелет дополнен у С17 алифатическим заместителем, и они представляют собой циклические спирты [13] .

Бета-ситостерин (бета-ситостерол) – белый или слегка желтоватый кристаллический порошок, нерастворимый в воде, растворимый в эфире и хлороформе. Молекулярная масса – 414.7067 г/моль. Температура плавления – 130–145° C.

Хотя бета-ситостерин не был до сих пор синтезирован, его получают из стигмастерина. Схема получения представлена на рисунке 2.

Первый этап: получение из стигмастерина (1) стигмастеринатозилата (2) путем замещения водорода в гидроксильной группе на тозил. Реакцию проводят в пиридине. Потом получают метиловый эфир сигма-

Рис. 2. Схема получения бета-ситостерина

стерина (4) и изо-метиловый эфир сигмастерина (3). Реакцию проводят в абсолютном метаноле в присутствии пиридина. Полученные изомеры разделяют препаративной хроматографией. Далее проводят гидрирование на платиновом катализаторе в растворе этилового спирта. Последний этап гидролиз в водном диоксане при температуре 80° С, в присутствии пара – тозиловой кислоты, происходит миграция OH группы в 3 положение с образованием бета-ситостерина (6). Совокупный выход продуктов – 55%, [14].

Биосинтез бета-ситостерина осуществляется преимущественно по меваланатному пути. Биосинтез фитостеринов несколько отличается от биосинтеза стероидов животного происхождения. В растениях первоначальным продуктом циклизации 2,3 – эпоксисквалена и предшественником фитостеринов является циклоартенол [15].

Химические свойства фитостеринов мало отличаются от свойств алициклических спиртов или алкенов.

Анализ фитостеринов основан на сочетании хроматографических и спектральных методов. Чаще всего используется: хромато – масс – спектрометрия, позволяющая в процессе анализа фракции идентифицировать ее по типу фрагментации. Цветные реакции представляют лишь теоретический интерес.

Выделение и идентификация бета – ситостерина из растительных экстрактов и в биологических жидкостях

Бета-ситостерин подвергается окислению, аналогично холестерину, что приводит к образованию оксида бета-ситостерина. Это делает выделение бета-ситостерина в чистом виде сложной задачей [16]. Для экстракции фитостеринов из растений широко используют органические растворители: гексан, хлороформ и метанол [17]. Обычный метод извлечения – приготовление хлороформного экстракта из растения, с последующим хроматографическим разделением на колонке с силикагелем.Чаще всего фракцию, содержащую бета-ситостерин, растворяют в смеси хлороформ: этанол (2:3) при последующем нагревании на водяной бане. При медленном охлаждении могут выпасть игольчатые кристаллы [17]. Использование больших количеств вредных органических растворителей может привести к проблемам со здоровьем, поэтому в некоторых случаях используют более «безопасный» метод сверхкритической флюидной экстракции (SFE).Сверхкритическая флюидная экстракция – процесс экстракции с использованием сверхкритического флюида в качестве растворителя. Производится контактированием смеси разделяемых компонентов с газообразным экстрагентом при температуре и давлении выше критической точки. Наибольшее распространение в качестве экстрагента (растворителя) получил СО2 т.к он нетоксичен, негорюч, невзрывоопасен, химически инертен, обладает низкой стоимостью [16].

Количественное определение бета-ситостерина в растениях чаще всего проводят методом ЖХ-МС с химической ионизацией при атмосферном давлении. В таблице 1 приведены различные методы количественного определения и пробоподготовки бета – ситостерина в различных растениях.

Для определения оксида или сложных эфиров бета-ситостерина применяется метод газовой хроматографии с массселективным детектором. Когда в растительном экстракте содержится одновременно бета-ситостерин и стигмастерин, их извлечение осложнено. Экстракт бета-ситостерина и стигмастерина в петролейном эфире делят хроматографическими методами с добавлением метанола. При разделении гексанового или петролейно-эфирного экстракта из растений методом ТСХ в качестве элюента могут быть использованы: петролейный эфир, хлороформ, гексан, этилацетат, хлороформ, метанол. Хроматограммы покажут характерные зоны для веществ стероидной структуры с реактивами Либермана-Бухарда, ванилин-серная кислота и анисовый альдегид-серная кислота. Подтверждение структуры бета-ситостерина осуществляется различными методами 1Н ЯМР, 13С ЯМР, ИК, масс – спектроскопии [17].

Среди опубликованных методов количественного определения бета-ситостерина в различных биобъектах приведены методы: ВЭЖХ, ГЖХ, ГХ-МС, ЖХ-МС. Описан метод количественного определения фитостеринов в плазме крови методом ГХ-МС в режиме селективного мониторинга (SIM). Образцы плазмы омыляли раствором KOH в этаноле, экстракцию проводили смесью гексан: этанол (20:1) , перед анализом фитостерины переводили в силильные производные, придел количественного опре-деления(LOQ)бета-ситостерина составлял 0,7 ммоль/л -1, придел детектирования (LOD) 0,2ммоль/л-1[22].

Табл. 1. Методы количественного определения и пробоподготовки бета-ситостерина

Биобъект Параметры сравнения	Плоды и экстракт пальмы ползучей(Serenoarepens)	Корневища банана (RhizomaMusae)	Оливковое масло	Пищевые продукты (кукуруза, кунжут, овсяная крупа, арахис)
Метод количественного определения	1    метод: ЖХ-МС с химической ионизацией при атмосферном давлении 2    метод: ГЖХ с пламенноионизационным детектором	ВЭЖХ с диодно-матричным детектором и испарительным детектором по светорассеянию	ЖХ-МС с химической ионизацией при атмосферном давлении	ЖХ-МС с химической ионизацией при атмосферном давлении
Пробоподготовка	Для 1 метода сначала проводили кислотный гидролиз 6М раствором HCL с последующим омылением этанольным раствором КOH. Далее проводили экстракцию толуолом. Для 2 метода пробопод-готовка проводилась аналогино, за исключением того, что перед анализом фитостерины переводили в силильные производные гексаметилдисиланом и триметилхлорсиланом	Измельченные корневища банана высушивали до постоянной массы, двухкратно экстрагировали метанолом из расчета 50 мл экстрагента на 1 г. сухого сырья. Экстракт концентрировали до 10 мл	Образец омыляли 2 N раствором KOHв этаноле, неомыляемую фракцию экстрагировали диэтиловым эфиром. Экстракт анализировали методом ТСХ, фитостерины выделяли экстракцией метанолом с пластины селикагеля	Высушенный гомогенезированный образец 1,2 г. экстрагировали 6 мл гексана или хлороформа 3 раза. Полученный экстракт упаривали на роторном испарителе при 30градусах. Остатки растворителя удаляли продувкой азотом. Сухой остаток экстрагировали сверхкритичным диоксидом углерода 2 часа при 55 градусах и 450 атм. После экстракции проводили омыление спиртовым раствором KOH. Неомыляемую фракцию экстрагировали петролейным эфиром Органический слой объединяли и упаривали при 40 градусах. Сухой остаток растворяли в смеси гексан–этилацетата. Полученный раствор очищали методом твердофазной экстракции на катриджах с силикагелем
Аналитический диапазон	0,06–960 нг	6,4–448 мг/мл	0,05–200 мг л-1	0,05–5 мг мл-1
Предел детектирования (LOD)	0,06 нг	0,03 мг/мл	123–677 нгмл-1	0,0023 мг мл-1
Предел количественного определения (LOQ)	0,2 нг	0,47 мг/мл	500–2515 нгмл-1	0,0076 мг мл-1
Источник литературы	[18]	[19]	[20]	[21]

Заключение

Наиболее изученным фитостерином является бета-ситостерин. Он обладает высоким потенциалом для лечения различных болезней. Основное фармакологическое свойство бета-ситостерина – гипохолестеринемическое. В литературе описаны различные методы количественного определения бета-ситостерина в растениях и в плазме крови: ВЭЖХ, ГХ-МС, ЖХ-МС. Поэтому актуальной является разработка различных методик пробоподговки и количественного определения бета-ситостерина в лекарственном растительном сырье и биообьектах.