Markers of apoptosis, cell proliferation, endothelial dysfunction in patients with peripheral atherosclerosis

семейства Bcl2. Оно включает в себя как ингибиторы (Bcl2 и др.), так и активаторы (Bcl-xS и др.) запрограммированной клеточной гибели. Соотношение между данными маркерами является определяющим в дальнейшей судьбе клетки [4].

Дисбаланс между пролиферацией и апоптозом клеток является ключевым фактором возникновения и прогрессирования атеросклероза. Одним из главных факторов, способствующим пролиферации клеток сосудистой стенки, является тромбоцитарный фактор роста ВВ (PDGF BB). Его повышенная экспрессия была обнаружена почти во всех типах клеток атеросклеротически измененной артериальной стенки. Выделено четыре лиганда тромбоцитарного фактора роста: PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D и два рецептора: PDGFR- α и PDGFR- β [5]. PDGF-B обладает более сильным пролиферативным и митогенным эффектами по сравнению с другими лигандами [6]. В ряде работ была показана взаимосвязь между высокой экспрессией PDGF BВ в артериях нижних конечностей и тяжестью ОААНК [7].

В настоящее время многочисленные работы направлены на изучение дисфункции эндотелия с позиций выработки NO, в то время как его взаимосвязь с показателями митохондриального пути апоптоза и пролиферации клеток остается до конца не исследованной у пациентов с атеросклерозом артерий нижних конечностей [8].

Цель исследования : определение показателей Всl2 и Вах, PDGF ВВ, NO при различных стадиях ОААНК.

Материалы и методы

Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики GCP (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинской Декларации. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом.

В проспективное, открытое исследование было включено 60 пациентов с ОААНК IIБ–IV стадией заболевания, которые проходили лечение в отделении сосудистой хирургии «Областной клинической больницы» г. Рязань. Средний возраст пациентов составил 64,3±6,5 лет. Количество мужчин — 34 (57 %). Для определения референтных значений в исследование были включены 20 здоровых добровольцев, у которых отсутствовали признаки атеросклеротического поражения. Средний возраст составил 65,4±7,3 лет, количество мужчин — 10 (50%). Критерии включения в исследование: мужчины или женщины старше 40 лет; наличие заболевания периферических артерий атеросклеротического генеза. Критерии исключения: оперативное лечение на магистральных артериях нижних конечностей в анамнезе, декомпенсированная соматическая патология, сахарный диабет, активный рак или период ремиссии менее 5 лет. Все пациенты получали традиционную консервативную терапию, согласно «Национальным рекомендациям по ведению пациентов с заболеваниями артерий нижних конечностей» [10].

Пациенты были разделены на три равные группы. В группу А вошли пациенты со IIБ стадией, в группу В — III стадией, в группу С — IV стадией заболевания. Все некротические изменения у пациентов с IV стадией заболевания представлены сухими некрозами без перифокального поражения, глубина некроза по Wagner 0–1 степени [9]. Давность заболевания у пациентов составляла от 6 до 12 месяцев. Группы были сопоставимы по возрасту и гендерному составу.

Характеристика пациентов различных групп представлена в таблице 1.

Исходно у всех пациентов получено информированное согласие. В образцах периферической венозной крови проанализировали 2 маркера апоптоза: про-апоптотический белок Вах и антиапоптический белок Всl2, пролиферации клеток — PDGF ВВ, дисфункции эндотелия — NO.

В сыворотке крови количество белков Всl2 (Human Bcl-2 ELISA Kit, «ThermoFisherScientific», Китай) и Bax (Enzyme — Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kit For

Табл. 1. Клиническая характеристика пациентов

Исходная анатомо-ангиографическая характеристика пациентов

Показатель, единицы измерения	Группа А	Группа В	Группа С
Аорто-подвздошный сегмент,n(%)	10 (50%)	13 (65%)	11 (55%)
Бедренно-подколенный сегмент, n(%)	10 (50%)	7 (35%)	9 (45%)

Сопутствующие заболевания

Ишемическая болезнь сердца, n(%)	10 (50%)	9 (45%)	11 (55%)
Постинфарктный кардиосклероз, n(%)	5 (25%)	4 (20%)	5 (25%)
Перенесенный ишемический инсульт в каротидном бассейне, n(%)	3 (15%)	5 (25%)	2 (10%)

Bcl2 Associated X Protein (Bax) «Сloud — CloneCorp», Китай), PDGF ВВ (Human PDGF-ВВ ELISA, Китай) определяли методом ИФА коммерческими наборами. Определение метаболитов NO в сыворотке крови проводилось фотоколориметрическим методом с помощью иммуноферментного анализатора StatFax 3200 («Aware-nessTecholog, Inc.»).

Статистический анализ данных проводился с использованием пакета статистических программ STATISTICA 10,0. В связи с отклонением от нормального распределения данных (использовался критерий Шапиро-Уилка, р>0,05) для дальнейшего анализа применялись непараметрические тесты: для сравнения двух независимых групп — U-критерий Манна-Уитни, в качестве корреляционного использовался тест Спирмена, при дисперсионном анализе применялся критерий Краскела-Уоллиса. Равенство дисперсий определялось по критерию Левина. Апостериорные сравнения в группах производились с использованием критерия Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Общий принятый уровень статистической значимости — р<0,05.

Результаты

У пациентов группы А (IIБ стадия заболевания) исследуемые показатели Всl2 (p = 0,554), Вах (p = 1,0), NO (р = 0,276), PDGF ВВ (р = 0,278) статистически значимо не отличались по сравнению со значениями здоровых добровольцев (табл. 2).

Табл. 2. Показатели Всl2, Вах, тромбоцитарный фактор роста ВВ, метаболиты оксида азота у пациентов группы А

Стадия заболевания	Показатели	Всl 2 (нг/мл)	Вах (нг/мл)	NO (мкм/мл)	PDGF ВВ (нг/мл)
Здоровые добровольцы	Медиана	5,3	13,1	339	8,5
	Нижняя и верхняя квартиль	[5,0; 5,8]	[12,5; 14,1]	[329; 350]	[7,5; 9,4]
Группа А	Медиана	6,5	13,5	298	10,1
	Нижняя и верхняя квартиль	[4,3; 9,4]	[10,3; 15,3]	[266; 346]	[8,7; 10,6]
р		0,554	1,0	0,276	0,278

Примечание: * — статистически значимые изменения, PDGF BB — тромбоцитарный фактор роста ВВ, NO — метаболиты оксида азота.

Табл. 3. Показатели Всl2, Вах, тромбоцитарный фактор роста ВВ, метаболиты оксида азота у пациентов группы В

Стадия заболевания	Показатели	Всl 2 (нг/мл)	Вах (нг/мл)	NO (мкм/мл)	PDGF ВВ (нг/мл)
Здоровые добровольцы	Медиана	5,3	13,1	339	8,5
	Нижняя и верхняя квартиль	[5,0 ;5,8]	[12,5; 14,1]	[329; 350]	[7,5; 9,4]
Группа В	Медиана	4,1	22,8	278	10,3
	Нижняя – квартиль	[2,1; 5,6]	[15,3; 28,8]	[91,4; 403]	[4,2; 17,1]
р		0,155	0,008*	0,299	0,677

Примечание : * — статистически значимые изменения, PDGF BB — тромбоцитарный фактор роста ВВ, NO — метаболиты оксида азота.

Табл. 4. Показатели Всl2, Вах, тромбоцитарный фактор роста ВВ, метаболиты оксида азота у пациентов группы C

Стадия заболевания	Показатели	Всl 2 (нг/мл)	Вах (нг/мл)	NO (мкм/мл)	PDGF ВВ (нг/мл)
Здоровые добровольцы	Медиана	5,3	13,1	339	8,5
	Нижняя и верхняя квартиль	[5,0; 5,8]	[12,5; 14,1]	[329; 350]	[7,5; 9,4]
Группа С	Медиана	5,0	26,4	202	29,1
	Нижняя и верхняя квартиль	[1,2; 6,3]	[14,4; 31,4]	[119; 272]	[12,4; 53,1]
р		0,576	0,007*	0,02	0,005*

Примечание : * — статистически значимые изменения, PDGF BB — тромбоцитарный фактор роста ВВ, NO — метаболиты оксида азота.

У пациентов группы В (III стадия заболевания) уровень РDGF ВВ и Вах был повышен при сниженном уровне NO и Всl2 по сравнению со значениями здоровых добровольцев, но статистически значимая разница была получена только для белка Вах (p = 0,008, табл. 3).

У пациентов группы С (IV стадия заболевания) также прослеживалась тенденция к увеличению значений показателей РDGF ВВ (р = 0,005) и Вах (р = 0,007) при дальнейшем снижении значения показателей NO по сравнению со значениями здоровых добровольцев (табл. 4).

При сравнении исследуемых показателей между группами А и В статистически значимая разница было получена только по показателю Вах (р = 0,004), а между группами В и С только по PDGF BB (р<0,001).

При сравнении показателей между группами А и С получены различия по показателям: PDGF BB (р = 0,001), Вах (р = 0,004).

Корреляционного анализа показал прямую взаимосвязь между показателями PDGF ВВ и Всl2 (r = +0,394) у пациентов группы В.

У пациентов групп С выявлена обратная корреляционная взаимосвязь между показателями PDGF BB и NO (r = -0,491) и между Всl2 и Вах (r = -0,517).

Обсуждение

Система апоптоза активно принимает участие в развитии и прогрессировании атеросклероза. В ходе нашего исследования мы показали, что активность системы апоптоза клеток также тесно связана со стадией развития заболевания. Так, при IIБ стадии заболевания значения двух белков апоптоза были сопоставимы со значениями здоровых добровольцев. При дальнейшем повышении стадии заболевания происходит повышение уровня проапоптотического белка Вах, что свидетельствует об активации система апоптоза при прогрессировании заболевания. Это согласуется с зарубежными исследованиями, которые показали, что при адаптивном утолщении интимы и образовании жировых полос определяется незначительная экспрессия белков Всl2 и Вах в сосудистой стенке. В прогрессирующих поражениях были выявлены очаги апоптоза, которые связаны с участками инфильтрации макрофагами и характеризовались серьезной потерей ГМК стенки артерии, что может привести к дестабилизации атеросклеротической бляшки [11].

В нашем исследовании показатель PDGF ВВ возрастал при увеличении стадии заболевания, что может быть обусловлено его функцией управления пролиферации клеток сосудистой стенки. Кроме того, PDGF повышает активность ядерного фактора- κ B (NF- κ B), который является ключевым регулятором атеросклероза [12]. Zhang Y., et al. (2015) показал, что высокие уровни экспрессии PDGF-A и PDGF-B присутствуют в атеросклеротических бляшка у пациентов с ОААНК [13].

Повышенные концентрация NO у пациентов со IIБ стадии заболевания говорят о высоком функциональном резерве эндотелия сосудов на ранних стадиях заболевания атеросклероза c последующем его истощением [14].

Выявленные корреляционные связь между Всl2 и PDGF ВВ можно объяснить тем, что Всl2 ингибирует гибель клеток, тем самым увеличивая количество клеток, которые подвергнутся пролиферации под воздействием PDGF ВВ. Полученная нами обратная взаимосвязь между NO и PDGF ВВ отражает функцию NO ингибировать пролиферацию клеток сосудистой стенки [15]. С ростом тяжести заболевания происходит активация как системы апоптоза, так и пролиферации клеток, что может выражаться в повышении показателя проапоптотического белка Bax и маркера пролиферации клеток PDGF ВВ.

На наш взгляд перспективным направлением является дальнейшие исследования данных показателей у пациентов, прошедших оперативное лечения, для изучения их влияния на развитие таких осложнений, как рестеноз и тромбоз зоны вмешательства.

Заключение

У пациентов с атеросклерозом периферических артерий нижних конечностей с увеличением стадии заболевания происходит повышение уровня проапоптотического белка Вах и тромбоцитарного фактора роста ВВ на фоне снижения уровня метаболитов оксида азота.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов (The authors declare no conflict of interest).