Skin microbiota of children with acute urticaria

Микробиота кожи является сложной экосистемой и зависит от возраста, пола, изучаемой области, преморбид-ного фона обследуемого, факторов окружающей среды и т.д. [1–4]. На коже верифицирован широкий паттерн микроорганизмов (около 1014 таксонов) [5]. Исследования микробиома кожи вошли в проект «Human microbiome project» [6] с индикацией 19 филов и доминированием Actinobacteria (51,8%), Firmicutes (24,4%), Proteobacteria (16,5%) и Bacteroides (6,3%) [7, 8]. Преобладающими родами являются Corynebacterium spp., Propionibacterium spp, Streptococcus spp [9]. Результаты бактериологического исследования микробиоты кожи во многих позициях корреспондируют с данными секвенирования 16S РНК бактерий данного биотопа[10, 11]. Отдельные атопические заболевания в своей основе имеют микробную этиологию, поэтому детальное изучение микробиоты кожи может привести к разработке новых методов и подходов к диагностике и лечению [12, 13]. Доказано, что эффективность терапии атопического дерматита ассоциируется с доминированием на коже Corynebacterium spp., Streptococcus spp., Propionibacterium spp. [14–16]. Крапивница является одной из сложных проблем современной аллергологии c распространенностью от 15 до 25% в человеческой популяции [17]. Это мультифакториальное заболевание, одним из основных звеньев патогенеза которого является накопление в тканях биологически активных веществ (гистамин и т.д.), что приводит к каскаду патологических реакций и соответствующей клинике [18]. Способность высвобождать гистамин из различных депо человека отмечена у S. aureus, H. pylori, P. aeruginosa и E. coli, что коррелирует с уровнем Ig E. Ряд таксонов микроорганизмов (Acinetobacter, Pseudomonas, Serratia, E. coli, Coryneb- acterium, Staphylococcus, Micrococcus), изолируемых с поверхности кожи здоровых людей и больных различными аллергическими заболеваниями, обладают выраженной гистидиндекарбоксилирующей активностью [19]. Эти данные позволяют предположить, что качественные и количественные изменения в микробиоте кожи могут оказывать значительное влияние на течение атопических заболеваний, в частности, острой крапивницы [20].

Материалы и методы

Проведено бактериологическое исследование микробиоты кожи 94 детям в возрасте от 3 до 12 лет. Обследуемые разделены на две группы: I группа – контрольная (n = 31), II группа (n = 63) дети с диагнозом острая крапивница. Критерии включения в I группу: возраст (3–12 лет), группы здоровья I и II a, информированное согласие родителей. Критерии включения во II группу: возраст (3–12 лет), диагноз – острая крапивница, отсутствие сопутствующих дерматологических заболеваний, информированное согласие родителей. Исследования проводили на базах: МБУЗ «Детская городская больница №2», педиатрическое отделение клиники РостГМУ и кафедра микробиологии и вирусологии №1 РостГМУ. У детей I группы исследовали микробиоту кожи средней трети внутренней поверхности предплечья. У детей II группы исследовали два участка кожи: пораженный и симметричный непораженный. Бактериологическое исследование кожи проводили по методике А.Б. Покатилова (1993) [21].Забор материала из изучаемых локусов проводили в соответствии с МУ 4.2.2 039-05 (2006), рекомендациями В.В. Меньшикова (2009) и P. Murray (2015) с помощью бакпечаток с различными питательными средами [22, 23].

Для факультативно – анаэробных бактерий (ФАБ) использовали среды Endo Agar, HiGrome Candida Differential Agar, HiGrome Enterococci Agar, HiGrome Aureus Agar Base, Blood Agar Base. Для выделения неклостридиально – анаэробных (НАБ) бактерий применяли Anaerobic Agar, Shaedler Agar, Bacteroides Bile Esculinum Agar. В работе использованы питательные среды Himedia (Индия). Посевы инкубировали в аэробных (24–48 часов, t-37° C) и анаэробных (48–72 часов, t-37° C) условиях культивирования. Для создания анаэробных условий использовали Anaero HiGas Pak. Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам с помощью энтеро-, стафило-, -неферм, анаэротестов (Lachema, Чехия).

Статистические расчёты выполняли в R (версия 3.2, R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). Результатом кластерного анализа стали построенные дендрограммы. Различия анализировали на основе оценок частот встречаемости и концентраций. Для анализа сходства использовали метод Варда (расстояние Брея – Кёртиса) [24]. Сравнение зависимых групп по средним значениям проводили с помощью критерия Вилкоксона для связанных выборок, по частотам – с помощью критерия Мак-Немара. При сравнении несвязанных групп использовали критерий Манна – Уитни и точный тест Фишера для средних и частот, соответственно.

Результаты исследования

При бактериологическом исследовании кожи в I группе верифицированы 12 таксонов микроорганизмов. Паттерн ФАБ представлен S. epidermidis (90,3%), Micrococcus spp. (61,3%), S. aureus (38,7%), Bacillus spp. (35,5%), Corynebacterium spp. (22,6%), S. haemolytic-us и Enterococcus spp. (по 16,1%). Спектр НАБ включал Peptococcus spp. (41,9%), Peptostreptococcus spp. (29,0%), Propionibacterium spp. и Veillonella spp. (по 16,1%), Eubac-terium spp. (9,6%). Обсемененность кожи ФАБ составила 2,5 ± 1,5 КОЕ/см2, НАБ – 2,1 ± 1,0 КОЕ/см2.

Во II группе (неизмененный участок кожи) обнаружено 13 микробных таксонов. Группа ФАБ представлена S. epidermidis (69,9%), S. aureus (53,9%), Micrococcus spp. (36,3%), Corynebacterium spp. (34,9%), Bacillus spp. (7,9%), S. pyogenes (4,8%). Таксономическая структура НАБ включала Peptococcus spp. (42,8%), Bacteroides spp. (30,1%), Peptostreptococcus spp. (28,6%), Propionibacte-rium spp. (26,9%), Veillonella spp. (11,9%), Eubacterium spp. (7,9%), Fusobacterium spp. (4,8%). Средние уровни обсемененности для ФАБ составили 3,2 ± 2,2 КОЕ/см2, НАБ – 1,7 ± 0,7 КОЕ/см2.

Во II группе (пораженный участок кожи) регистрировали 11 таксонов микроорганизмов. ФАБ представлены S. aureus (69,8%), S. epidermidis (60,3%), Corynebacterium spp. (23,8%), Micrococcus spp. (20,6%), Bacillus spp. (7,9%), S. pyogenes (4,8%). Паттерн НАБ включал Peptococcus spp. (61,9%), Propionibacterium spp. (39,7%), Peptostrep-tococcus spp. (36,5%), Bacteroides spp. (20,6%), Veillonella spp. (14,3%). Средняя обсемененность ФАБ составила 2,9 ± 2,0 КОЕ/см2, НАБ – 1,7 ± 0,6 КОЕ/см2.

При анализе дендрограммы (рис. 1) подобия частот встречаемости выявлен низкий уровень отличия между спектрами микроорганизмов, верифицированных на коже детей I и II групп.

Однако при сравнении частот встречаемости (тест Фишера) различных таксонов микроорганизмов, обнаруженных на коже детей I и II (неизмененная кожа) групп, выявлены достоверные отличия по 4 микроорганизмам (рис. 2). На неизмененном участке кожи детей II группы повышена частота обнаружения Bacteroides spp. (р < 0,001) и снижена – Enterococcus spp. (р = 0,009), S. haemolyticus (р = 0,009) и Bacillus spp. (р = 0,007).

При сравнении частот встречаемости микроорганизмов между I группой и II (пораженный участок кожи) с помощью теста Фишера, с поправкой на множественные сравнения по методу Холма, статистически значимые различия выявлены по 7 таксонам (рис. 3). Во II группе отмечено повышение частоты обнаружения Bacteroides spp. (р = 0,008), S. aureus (р = 0,02) и снижение – Enterococcus spp. (р = 0,009), S. epidermidis (р = 0,01), S. haemolyticus (0,009), Micrococcus spp. (р < 0,001) и Bacillus spp. (р = 0,007).

Рис. 1. Иерархическая кластеризация результатов исследования по встречаемости микроорганизмов

10, 0..

I I I группа

II группа (неизмененная кожа)

Рис. 2. Частоты обнаружения (%) микробиоты у детей I группы и II (неизмененная кожа)

II группа (неизмененная кожа) I II группа (пораженная кожа)

I    I I группа

I    I II группа (пораженная кожа)

Рис. 3. Частоты обнаружения (%) микробиоты у детей I группы и II (пораженная кожа)

При сравнении частот обнаружения микроорганизмов (критерий Мак-Немара) у больных II группы в двух локусах (неизменный и пораженный участки кожи) наблюдали повышение изучаемого показателя для S. aureus (р = 0,002) и Peptococcus spp. (р = 0,023) (рис. 4).

Заключение

Проведенный кластерный анализ показал низкий уровень отличия спектров бактерий между контрольной группой и пациентами с крапивницей, включая неизмененные и пораженные участки, т.е. микробные паттерны кожи у здоровых детей и больных крапивницей схожи. Однако, установлены статистически значимые различия частот встречаемости микроорганизмов, верифицированных на коже детей I и II групп. На пораженном участке по сравнению с контролем выявлены различия по 7 таксонам микроорганизмов, на неизмененном – по 4 таксонам. Сравнение микробных спектров двух локусов у детей II группы выявило статистически значимые различия для 2 таксонов микроорганизмов. Выявленные изменения в микробиоте кожи детей с крапивницей предполагают введение в план терапии заболевания симбиотических препаратов.