Intravitreal implantation biodegradable cross-linked poly (vinyl alcohol), as a drug-releasing implant (experimental trials)

Фармакологическое лечение диабетической ретинопатии (ДР), остается нерешенной проблемой, что обусловлено особенностями анатомии глаза. Системное назначение (внутривенное, внутриартериолярное) препаратов, сопровождается токсическим воздействием на весь организм [7], а местное назначение не позволяет создать оптимальную концентрацию препарата в пораженных тканях, (подконъюнктивальное, парабуль-барное, субтеноновое) [2]. Препятствием служат низкая проницаемость склеры и гематоофтальмический барьер. Широкое распространение интравитреальных инъекций, позволило добиться оптимальной концентрации препарата в стекловидной камере и минимизировать побочные эффекты системного характера [6, 9]. Однако, активный обмен веществ во внутриглазных структурах сокращает период полувыведения препаратов и определяет необходимость повторных инъекций. Велением времени становится не только адресная доставка препарата, но и пролонгация его действия с сохранением высоких концентраций в месте приложения [6, 8]. В поисках рационального решения проблемы, рядом исследователей было предложено применять препараты на биологически индифферентных химических носителях и имплантировать их интравитреально, так называемые полимеры-депо с постепенным высвобождением фармпрепарата. Примером могут служить полимеры полимолочной кислоты или поливинилового спирта [11, 12, 13], и уже разрешенные к применению интраокулярные имплантаты Retisert (Baush and Lomb) и Posurdex (Allergan), содержащие стероиды. Несмотря на клинический успех имплантатов, риск развития осложнений (катаракта и глаукома) не позволяет расширить круг показаний для их применения [10, 13].

В работе был использован модифицированный поливиниловый спирт (Mn=12х103), способный образовывать сшитую систему в присутствии инициаторов радикальной полимеризации – аскорбиновой кислоты и перекиси водорода (заявка на изобретение № 2006125-842/15(028036)). Способность к биодеградации данного полимера является положительным моментом, поскольку не требует хирургического удаления остатков носителя из организма. Продукты деградации полимера – фрагменты поливинилового спирта легко выводятся из организма, не токсичны, 2–3%-ный растворы его используют в качестве кровезаменяющего препарата [4, 12, 13].

В поисках путей клинической реализации этой задачи нами проведены предварительные экспериментальные исследования с использованием гелеобразного имплантата.

Материал и методы

Объектом для экспериментального изучения действия сшитой формы имплантата служили 28 глаз 14 кроликов породы «шиншилла» половозрелого возраста (13–17мес.) – группа I. Вес животных 2,5–3,0 кг. Серочерной окраски. Группу II (контрольную) составили 6

здоровых кроликов (12 глаз) той же породы и окраски, такого же возраста и веса. Клинические методы исследования: тонометрия, биомикроскопия и офтальмоскопия (60D) были проведены на 1-е, 3-и, 10-е сутки и через 1, 2 и 3 месяца от начала эксперимента. Динамику ретинального электрогенеза (ЭРГ) при интравитреальном введении полимера изучали до введения полимера и на 1-е, 3-и, 10-е сутки и через 1 месяц от начала эксперимента. ЭРГ регистрировали на одиночную (1Гц) и ритмическую (30Гц) стимуляцию с помощью электрофизиологической минисистемы для животных «Mjolner» (Global EYE Program AB, Швеция). Статистическую обработку данных проводили средствами программ AnalystSoft Biostat 2007.

Приготовление раствора для интравитреальной инъекции осуществляли в инсулиновом шприце смешением раствора исходного сшиваемого полимера (5 масс. %) с инициирующей системой (2 мг/мл аскорбиновой кислоты и 2 мг/мл перекиси водорода) [1, 12].

Рис. 1. Биодеградирующая система на основе сшитого поливинилового спирта: А – жидкая форма исходного полимера (до сшивки); Б – плавающие в физиологическом растворе нити полимера, образующегося после сшивки, окрашенные трипановым синим для визуализации

Исследования in vitro

Полученный полимер оставался прозрачным, сохранял форму в виде нитей. После насыщения трипановым синим in vitro и помещения полимера в физиологический раствор 0,9% NaCl в течение 20–27 минут выделял краситель, однако полного выделения красителя за это время не наблюдалось. Через 6 месяцев нахождения в физиологическом растворе полимера дальнейшего выделения красителя не произошло. Так же не наблюдалось и деградации полимера.

Исследования in vivo.

Животным группы I (28 глаз) в условиях общей анестезии под контролем операционного микроскопа интравитреально инъекционной иглой 30G через pars plana вводили 0,1мл раствора исходного сшиваемого полимера с инициирующей системой. Предварительно через парацентез роговицы выпускали 0,1 мл внутриглазной жидкости. Поскольку имплантат, в стекловидном теле (СТ) у 8 кроликов (16 глаз) не визуализировался при биомикроскопии, 6 кроликам (12 глаз) был введен имплантант, окрашенный трипановым синим. Животным группы II – (12 глаз) под общей анестезией интравитреально вводили 0,1 мл сбалансированного раствора BSS®.

Работу с животными выполняли согласно требованиям нормативного документа «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77). Животные содержались в виварии согласно «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» (Утвержденный главным государственным санитарным врачом СССР от 06.04.1973 №1045-73).

Из эксперимента животных выводили поэтапно передозировкой препарата «Наркотан» в сроки 1, 3, 10 день и 1, 2 и 3 месяцы от начала эксперимента (3 кролика 6 глаз на каждый срок наблюдения). В группе II забор материала на 1, 3 день и через 1 месяц по 2 кролика (4 глаза) на каждый срок наблюдения. Полученный материал фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида, с последующей проводкой в спиртах восходящей концентрации. Заливали в среду Аралдит-М и готовили ультратонкие срезы (1 мкм) на ультрамикротоме LKB-4800 (Швеция). Окраска метиленовым синим и основным фуксином (163 среза).

Результаты и обсуждение

Состояние кроликов сразу после имплантации удовлетворительное. При осмотре отмечали небольшую гиперемию конъюнктивы в области послеоперационной раны, выпадения СТ в рану нет, роговица прозрачная, передняя камера несколько мельче средней. При биомикроскопии помутнения хрусталика и ятрогенного повреждения внутриглазных структур не отмечено. У 6 кроликов (12 глаз) в СТ видны свободно плавающие тонкие нити имплантата светло синего цвета. У всех животных сетчатка прилежит на всем протяжении, кровоизлияний нет.

У одного кролика к концу 1 суток развился резко выраженный эндофтальмит. Парный глаз оставался спокойным. Мы сочли это следствием нарушения правил асептики и антисептики, и глаз был выведен из эксперимента, количество исследуемых глаз составило 27 (n=27).

У животных I группы через 1 сутки в области инъекции отмечались незначительная гиперемия и отек в 11,1% наблюдений. На 3 сутки явления раздражения усилились: у животных появились светобоязнь (62,9%) и беспокойство (59,3%) при пальпации глаз через веки, перикорнеальная инъекция у 12 (44,4%) животных. При биомикроскопии на 3 сутки отмечали отек и сглаженность рисунка радужки в 76,2% наблюдений, единичные преципитаты в 52,4% случаев, а также слабую опалесценцию СТ (2 степень по Nussenblatt R.B. et al., 1985) в 7 глазах. У 6 кроликов (12 глаз) в СТ были видны неизмененные нити полимера. При офтальмоскопии во всех случаях отмечали полнокровие и извитость сосудов сетчатки, небольшой отек по ходу вен в виде бело-серых полос сопровождения. Единичные штрихообразные геморрагии по ходу сосудов, появившиеся на 3 сутки после имплантации у 6 (28,6%) животных, к 10 суткам увеличились в размерах и количестве. Отек сетчатки по ходу вен к 10 суткам распространился на всю её площадь. Вокруг вен появились сероватые утолщения. Через 1 месяц явления воспаления переднего отрезка полностью купировались. Помутнение СТ значительно усилилось (4 степень) и офтальмоскопия была затруднена. У животных появились признаки катаракты (макропрепарат на Рис. 2).

Рис. 2. Макропрепарат сагиттального разреза глаза экспериментального животного (группа I): a – помутневший хрусталик; б – уплотненное стекловидное тело

Изменения глаз животных после имплантации полимера представлены в таблице №1. Поскольку, в определенные сроки наблюдения часть животных выводилась из эксперимента для забора материала, количество исследуемых глаз в последующем уменьшалось.

У всех животных до и в течение 1 месяца после имплантации полимера велся контроль внутриглазного давления (ВГД). Результаты контроля ВГД у подопытных животных представлены на рисунке 3.

Исходное ВГД животных составило 16,7±2,3 мм рт.ст. в основной группе и 15,8±2,3 мм рт.ст. в контрольной группе. В течение первых 3 дней отмечалось постепенное повышение ВГД до 20,1±1,9 мм рт. ст. (р<0,05), с колебаниями 17–24 мм рт.ст. (норма 12–20 мм рт.ст.) к 1 суткам и до 21,0±1,8 мм рт. ст. (р<0,05), с колебаниями 17–25 мм рт.ст. к 3 суткам. Причиной повышения ВГД, на наш взгляд, явилось набухание полимера. К 10 суткам наметилась тенденция к постепенному снижению ВГД до 18,3±2,1 мм рт.ст. К концу 1 месяца наблюдения средние величины ВГД были ниже исходных (14,4±2,7 мм рт.ст), что можно объяснить гипофункцией цилиарного тела после перенесенного воспаления. У животных II группы повышение

Табл. 1. Клиническая характеристика органа зрения животных с интра-витреальной имплантацией полимера в зависимости от сроков наблюдения

	1 сутки	3 сутки	10 сутки	1 мес
	(n=27)	(n=21)	(n=15)	(n=9)
Гиперемия и отек конъюнктивы	3 (11,1%)	17 (80,9%)	–	–
Беспокойство при пальпации	16 (59,3%)	15 (71,4%)	11 (73,3%)	–
Светобоязнь	17 (62,9%)	15 (71,4%)	10 (66,7%)	–
Отек роговицы	–	2 (9,52%)	2 (13,3%)	–
Сглаженность рельефа радужки	–	16 (76,2%)	9 (60,0%)	4 (44,4%)
Уменьшение глубины п/к	18 (66,7%)	13 (61,9%)	7 (46,7%)	2 (22,2%)
Опалесценция влаги п/к	–	11 (52,4%)	9 (60,0%)	–
Опалесценция стекловидного тела	–	7 (33,3%)	12 (80,0%)	9 (100%)
Ретинальные геморрагии	–	6 (28,6%)	10 (66,7%)	–
Катаракта	–	–	–	9 (100%)

Рис. 3. Динамика показателей внутриглазного давления у животных после интравитреального введения полимерного материала

ВГД было отмечено только в 1 сутки до 21,3±0,4 мм рт.ст., к 3 суткам давление у всех кроликов нормализовалось и сохранялось на этих уровнях до конца исследования.

Электрофизиологические исследования у животных I группы выявили умеренное снижение (до 82–77% от исходных значений) амплитуды а-волны ганц-фельд ЭРГ в 1 сутки после введения полимера (рис. 4). На 3 сутки наблюдали картину гиперреакции (152–168% от исходных значений), сохраняющуюся до 10 суток эксперимента. Динамика амплитуды b-волны ЭРГ напоминала характер изменений а-волны. Через сутки наблюдения у животных диагностировали угнетение b-волны (до 54–63%). На 3 сутки амплитуда b-волны была увеличена до 124–132% от исходного уровня. А к 10 суткам амплитуда b-волны была в пределах ±17% от исходных показателей (рис. 5). К концу 1 месяца у животных I группы регистрировали выраженное угнетение a- и b-волн ретинограммы (4053% и 38–49% соответственно от исходных показателей). У животных группы II в ответ на интравитреальную инъекцию отмечалась депрессия a- и b-волн (82–89% и 71–80% соответственно). Восстановление b-волны наблюдалось к 3 суткам, а восстановление a-волны только к 10-м. Спустя 1 месяц после введения BSS ЭРГ животных группы II соответствовало исходным уровням.

Рис. 4. Динамика a-волны ЭРГ у животных группы I

Примечание: Вследствие малого количества наблюдений и большого разброса показателей данные на графиках представлены не в виде абсолютных значений, а в процентах от исходных значений амплитуд волн ЭРГ (в контрольных точках медиана)

Рис. 5. Динамика b-волны ЭРГ у животных группы I

Выявленные изменения ЭРГ свидетельствуют о токсическом воздействии полимера на электрогенез сетчатки. Обнаруженная в первые сутки депрессия a- и b-волн ЭРГ у животных обеих групп (субнормальная ЭРГ) служит отражением ответной реакции на интраокулярную инъекцию. Картина супернормальной ЭРГ, отмеченная при введении полимера на 3–10 сутки, может быть связана с повышением количества раздражающих нейромедиаторов в сетчатке, что является ранним признаком медикаментозной интоксикации [5]. Регистрируемая к концу 1 месяца плюс-негативная ЭРГ, характеризующаяся выраженной депрессией a- и b-волн, является проявлением дистрофических изменений в ретинальной ткани и хороидеи, вследствие токсического влияния полимера.

По данным световой микроскопии у животных I группы изменения со стороны дренажной зоны и роговицы были минимальными. Были выявлены дегенеративные изменения единичных клеток заднего эпителия роговицы. На 1–3 сутки на гистологических срезах радужки, отмечены умеренный отек глубоких слоев стромы, разрушение отдельных эндотелиальных клеток и незначительное сужение просвета капилляров (Рис. 6А). На уровне заднего пограничного листка отмечена гибель единичных клеток пигментного эпителия. На 10 сутки на препаратах радужки изменения преимущественно были локализованы в заднем пограничном листке, т.е. в структуре, непосредственно контактирующей со СТ. Отмечена характерная реакция меланоцитов стромы, что свидетельствует о несомненной токсичности полимера (Рис. 6Б). А также очаговая облитерация капилляров, появлении отека и не-кробиотических изменений в периваскулярных муфтах.

На 3 сутки микроскопия препаратов сетчатки свидетельствовала о разрушении наружных сегментов фоторецепторов. В наружном ядерном слое наблюдались очаговая деструкция и лизис ядерного содержимого. Во внутреннем ядерном слое отмечали дезорганизацию клеточных элементов и деструктивные изменения нейронов. На препаратах, забранных на 10 сутки, на протяжении всей области контакта сетчатки с полимером наблюдался практически полный лизис наружных слоев сетчатки и очаговая деструкция внутреннего ядерного слоя (Рис. 7). Отмечено также резкое полнокровие венозной сети хоро-идеи (Рис. 8С), плазматическое пропитывание и разволокнение сосудистых стенок, периваскулярный отек с диа-педезным выходом эритроцитов (Рис. 8Б), межуточный и внутриклеточный отек нейроглии сетчатки, с высокой степенью выраженности в зонах адгезии полимера к поверхности сетчатки, диффузное и очаговое утолщение мембраны Бруха. На препаратах также была обнаружена выраженная лимфоидная инфильтрация сетчатки и хороидальной ткани (Рис. 8А), и дистрофические изменения ретинального пигментного эпителия. В СТ на гистологических срезах обнаружен полимер, на различных стадиях деградации: от плазматического пропитывания (Рис. 9А) до полного лизиса макрофагами (Рис.9Б).

Рис. 6. Гистологический срез тканей радужки. В строме крипт радужки отдельные тромбированные сосуды, отек периваскулярной ткани (а). Характерная реакция меланоцитов стромы (Б) (Окраска: метиленовая синь, основной фуксин. Увеличение Х100-200)

Рис. 7. Гистологический срез тканей глаза. Дезорганизация слоя фоторецепторов и пигментного эпителия. Расслоение мембраны Бруха (10 сутки после имплантации). Окраска: метиленовая синь, основной фуксин. Увеличение Х100

Б

А

В

Рис. 8.

Гистологический срез хороидальной ткани. Лимфоидная инфиль-трация(А) и отек хороидеи (Б) в зоне контакта жидкого полимера с ретинальной тканью, резкое полнокровие и расширение хороидальных сосудов, стаз крови (В). Окраска: основной фуксин и метиленовая синь, ув.Х100

Рис. 9. Гистологический срез тканей глаза. Биодеградация нитей полимера в витреальном геле. Окраска: основной фуксин и метиленовая синь, увеличение Х100. А – нити полимера срок наблюдения 10 дней, Б – деградировавшийся полимер спустя 3 месяца: плазматически пропитанный полимер (1), остатки эрозированного полимера в витреальной полости (2), значительная лимфоидная инфильтрация (3)

Изменения в структурах глаза кроликов контрольной группы значительно отличались от опытной группы. На препаратах роговица сохраняла нормальную структуру, целостность и пластичность всех слоев без каких-либо патологических отклонений. На гистологических срезах радужки, цилиарного тела и сетчатки также были отмечены правильная структура с обычным клеточным составом, нормальный калибр сосудов без признаков дистрофии, токсического повреждения и воспалительной реакции.

Результаты гистологического исследования дополняют клинико-функциональные наблюдения и свидетельствуют о токсическом действии использовавшейся полимерной системы на внутренние оболочки глаза экспериментальных животных.

Заключение

Результаты выполненных экспериментальных исследований достоверно свидетельствуют о выраженном токсическом воздействии исследовавшейся формы полимера на структуры заднего отрезка глаза животных при его интравитреальном введении. Полученные данные отличаются от положительных результатов исследований о возможности применения данного имплантата в торакальной хирургии. Это подтверждает особые требования к фармпрепаратам и имплантатам, которые планируется применять для интравитреального введения. Отрицательный результат данного исследования требует продолжения изысканий в этом направлении, также как и поиска других возможных, не менее эффективных, но более безопасных путей доставки лекарственных веществ к внутренним структурам глаза.