Hydro- and ion-excretory renal function in rats under the oxidative stress

Введение. Анализ публикаций, посвященных свободнорадикальной патологии, позволяет считать, что нарушение редокс-гомеостаза и развитие окислительного стресса лежат в основе патогенеза многих заболеваний (Капелько, 2003; Меньшикова и др., 2008; Кормош, 2012; Луцкий и др., 2014; Губский, 2015). Роль свободнорадикальных механизмов в изменении функционального состояния органов различных функциональных систем при перманентном поступлении глюкокортикоидов остается недостаточно изученной (Порядина, 2009). В силу мощной терапевтической активности и разносторонности действия на организм, синтетические глюкокортикоиды активно используются в медицине при лечении различных заболеваний - ревматических, инфекционных и др. (Мурзин, 2015; Кароли, Ребров, 2016). Высокая эффективность этих препаратов позволяет использовать их в наиболее тяжелых клинических ситуациях, нередко они включаются в комплекс экстренных мер помощи при неотложных состояниях. Использование стероидных препаратов сопровождается развитием многочисленных осложнений, риск появления которых, как правило, повышается с увеличением доз и длительности их применения (Новожилова, 2015; Морозова и др., 2016; Парамонов, 2016). Считается, что в развитии осложнений при лечении глюкокортиткоидами сочетаются специфические реакции прямого подавления стероидами функциональной активности клеток и неспецифические реакции повышения процессов липопероксидации (Меньшикова и др., 2008; Губский, 2015).

Патологические проявления свободнорадикального окисления органических молекул в внутриклеточном и внеклеточном компартментах могут стать причиной нарушения динамического баланса активных компонентов внутренней среды организма, опосредующих через свободнорадикальный механизм сублетальное и летальное повреждение клеток. Почки являются ключевым органом, стабилизирующим системный ионный гомеостаз в организме. Благодаря этому осуществляется поддержание объема крови и внеклеточной жидкости, регуляция осмотически активных веществ и водно-солевого состава жидкостных сред.

В доступной литературе нами обнаружены весьма противоречивые описания патогмонической клинической картины повреждения структурных элементов нефрона активными метаболитами кислорода. В этой связи расширение представлений о влиянии свободных радикалов на функции почек при окислительном стрессе представляется актуальным.

Целью настоящей работы являлась оценка влияния окислительного стресса, индуцированного длительным приемом глюкокортикоидов на функции почек крыс.

Методика. Исследование проводили на самцах крыс линии Вистар массой 250-300 г. Манипуляции с животными осуществлялись в соответствии с международными принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Все крысы были распределены в 4 группы - интактная и три группы сравнения, по б особей в каждой. Животных интактной группы содержали в стандартных условиях вивария без ограничения доступа к воде и корму. Крысам всех групп сравнения ежедневно в течение 14 суток вводили водную суспензию синтетического глюкокортикоида «Преднизолон» («Никомед Австрия ГмбХ», Австрия) в дозе 50 мг/кг с помощью внутрижелудочного зонда, инициируя у них развитие ОС (Валеева и др., 2002.). Для чистоты эксперимента и стандартизации манипуляций, связанных с введением в организм веществ, крысам первой группы сравнения (ГКОС) через три часа после преднизолона вводили 0,2 мл водопроводной воды. Животные второй группы сравнения (ГКОС+Т) по аналогичной схеме получали 0,2 мл эмульсии полифункционального серосодержащего антиоксиданта нового поколения «Тиофан» (тио-фан-бис-[(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропил]сульфид, НИИ химии антиоксидантов НГПУ, Россия) в дозе 100 мг/кг массы тела. В связи с тем, что «Тиофан» -жирорастворимый антиоксидант, крысам третьей группы сравнения (ГКОС+М), после приема преднизолона внутрижелудочно вводили только растворитель антиоксиданта «Тиофан» - растительное масло (0,2 мл).

На 15 сутки эксперимента проводили исследование функций почек путем анализа фоновых проб мочи, собранной в метаболических клетках за 6-8 часов наблюдения, и оценки почечной реакции у животных всех групп на 5% водную нагрузку, введенную внутрижелудочно с помощью зонда. Пробы мочи собирали в течение 3 часов, после чего у крыс всех групп под эфирным наркозом из нижней полой вены брали пробы крови объемом 5 мл для последующего анализа физико-химических показателей плазмы.

Таблица 1 Расчет парциальных функций почек

Показатель	Обозначение	Формула расчета	Единица измерения
Диурез	V	D*100/t*M	мл/100г*час
Скорость клубочковой фильтрации	GFR	Ucr*v/Pcr	мл/100г*час
Относительная реабсорбция жидкости	RlI2O	GFR-V/GFR*100	%
Экскреция ионов натрия	uNa*v	uNaw	мкмоль/100г*час
Экскреция ионов калия	uK*v	UK*V	мкмоль/100г*час
Экскретируемая фракция натрия	EFNa	(UNa*V/GFR*PNa)	%
Экскретируемая фракция калия	EFK	(UK*V/GFR*PK)	%
Показатель	Обозначение	Формула расчета	Единица измерения
Очищение осмотически активных веществ	с ^osm	U *V/P osm v 'A osm	-

Примечание. D — количество мочи (мл), t — время, в течение которого собирали порцию мочи (час), М - масса тела (г), U_cr и Р_сг - концентрация креатинина в моче и плазме (мг%); U_Na и P_Na - концентрация натрия в моче и плазме (ммоль/л); U_K и Р_к -концентрация калия в моче и плазме (ммоль/л); U_osm и P_osm - концентрация осмотически активных веществ в моче и плазме (мосмоль/л).

В пробах мочи и плазмы крови определяли концентрацию ионов натрия и калия методом атомно-эмиссионного анализа с индуктивно связанной плазмой (спектрометр Optima 2100 DV (Perkin Elmer, США), шифр методики КХА: МУК 4.1.1482-03). Концентрацию креатинина в исследуемых жидкостях оценивали по интенсивности цветной реакции Яффе (спектрофотометр Spekol 10 (Zeiss, Германия), Л = 490 нм), а концентрацию мочевины исследовали по цветной реакции с использованием парадиметиламинобензальдегида (спектрофотометр Spekol 10 (Zeiss, Германия), X = 343 нм). Определение осмолярности в образцах мочи и плазмы крови проводили методом криоскопии (миллиосмометр «МТ-2” (НПП «Буревестник», Россия). Парциальные функции почек (табл. 1) рассчитывали по общепринятым формулам (Лакин, 1980; Наточин, 1997). '

Статистический анализ результатов исследования проводили на основе определения медианы и квартилей (Me (Q25;Q75). Различия показателей между группами оценивали методом вариационной статистики по непараметрическому U-критерию Манна-Уитни для независимых выборок и считали статистически значимыми при уровне р < 0,05. Расчеты производили по общепринятым формулам с использованием стандартных программ пакета Statistica 7.0 for Windows.

Результаты и обсуждение. В результате анализа проб плазмы крови животных, длительно получавших глюкокортикоиды, установлено, что в их крови происходит повышение концентрации креатинина и мочевины, выраженная тенденция к гиперкалиемии и гипонатриемии (табл. 2). Обнаруженные гомеостатические сдвиги указывают на развитие у крыс первой группы сравнения почечной недостаточности. Подобные изменения зарегистрированы в крови животных третьей группы сравнения.

У крыс на фоне приема глюкокортикоидов и получавших на протяжении всего эксперимента полифункциональный серосодержащий антиоксидант нового поколения «Тиофан», происходило статистически значимое снижение концентрации креатинина, мочевины и ионов калия относительно аналогичных показателей животных первой группы сравнения (табл. 2).

Таким образом, при сочетанном использовании глюкокортикоидов и антиоксиданта «Тиофан» отмечается коррекция негативных изменений ионо-осмотических показателей плазмы крови и их приближение к значениям интактных крыс. Полученные результаты согласуются с данными ранее проведенных нами исследований, в ходе которых было показано, что на фоне длительного приема глюкокортикоидов в плазме крови у крыс регистрируется повышение уровня активных метаболитов кислорода и снижение активности ключевых ферментов антиоксидантной защиты (каталазы и супероксиддисмутазы). Использованный в работе подход позволяет считать, что сочетанное использование «Преднизолон» и синтетического серосодержащего полифункционального антиоксиданта «Тиофан» оптимизируют процессы свободнорадикального перекисного окисления липидов в плазме крови и приближают показатели липопероксидации у крыс к значениям интактных животных (Луканина и др., 2013).

Таблица 2 Показатели плазмы крови у крыс исследуемых групп (Медиана (Q25;Q75)

Группы животных	Р Na? ммоль/л	Рк, ммоль/л	р 1 osm, мосмоль/л	р мг%	р мг%
Интактные	147,00 (146,00; 148,75)	3,95 (3,68; 4,23)	263,50 (252,63; 281,50)	2,10 (1,95; 2,18)	40,00 (32,25; 41,00)
1 группа сравнения (ГКОС)	134,00* (132,50; 138,50)	4,70* (4,45; 5,10)	294,50* (293,00; 298,25)	8,28* (6,50; 10,54)	272,00* (260,50; 290,25)
2 группа сравнения (ГКОС+Т)	141,00 (136,73; 144,75)	4,05** (3,90; 4,50)	282,00 (279,25; 295,25)	3,30** (2,38; 3,85)	83,50** (79,00; 91,75)
3 группа сравнения (ГКОС+М)	136,00 (126,50; 145,50)	4,75 (4,45; 4,90)	302,00 (251,00; 324,50)	8,28 (7,50; 8,89)	299,00 (243,00; 317,50)

Примечание. Здесь и в последующих таблицах * - отличия показателей животных интактной и 1 группы сравнения; ** - отличия показателей животных 1 и 2 групп сравнения; # - отличия показателей животных 1 и 3 групп сравнения; р<0,05.

На следующем этапе работы оценивали функциональное состояние почек крыс при глюкокортикоид-индуцированном окислительном стрессе. В ходе анализа фоновых проб мочи было обнаружено, что у животных 1 группы сравнения, длительно принимавших «Преднизолон», имеются признаки полиурии. Это выражается в статистически значимом увеличении диуреза и снижении экскреции осмотически активных веществ (табл. 3). Подобные изменения зарегистрированы и у крыс 3 группы сравнения. С нашей точки зрения, данный эффект обусловлен снижением скорости клубочковой фильтрации и уменьшением относительной реабсорбции жидкости в канальцах нефронов.

Использование антиоксиданта «Тиофан» проявило выраженный нефропротекторный эффект, что заключалось в коррекции гидроуретической функции почек. Так, у крыс 2 группы сравнения, отмечалось повышение СКФ и %Rh2o относительно аналогичных показателей животных 1 группы сравнения.

Известно, что наиболее информативной характеристикой функциональных возможностей почек является их способность экскретировать водные и солевые нагрузки (Айзман, Великанова, 1980). Поэтому на следующем этапе работы была проведена оценка ответной реакции почек у крыс на 5%-ную водную нагрузку, вызывающую максимальную гидроуретическую реакцию.

Таблица 3

Гидроуретическая функция почек крыс исследуемых групп в покое и после водной нагрузки (Медиана (Q25;Q75))

Группы животных		V, мл/100г*ч	GFR, мл/100г*ч	% Rh2O	Cosm, мл/100г*ч
Интактные	Фон	0,17 (0,11; 0,21)	23,51 (15,74; 28,21)	99,28 (99,14; 99,34)	0,78 (0,66; 1,38)
	Ср. за 3 часа	1,51 (1,19; 1,80)	21,52 (17,75; 25,42)	93,15 (92,35; 93,42)	0,66 (0,51; 0,83)
1 группа сравнения (ГКОС)	Фон	0,37* (0,28; 0,50)	8,22* (4,57; 9,80)	94,03* (92,91; 94,72)	0,64 (0,54; 0,71)
	Ср. за 3 часа	0,97* (0,85; 1,10)	6,27* (4,94; 7,54)	82,13* (78,72; 85,56)	0,50 (0,44; 0,61)
2 группа сравнения (ГКОС+Т)	Фон	0,19** (0,14; 0,23)	11,79 (10,40; 13,75)	98,51** (98,02; 98,95)	0,48** (0,44; 0,50)
	Ср. за 3 часа	1,13 (0,93;1,41)	11,09** (8,27; 13,10)	89,21** (85,49; 92,23)	0,61 (0,50; 0,70)
3 группа сравнения (ГКОС+М)	Фон	0,33 (0,32; 0,36)	6,37 (5,34; 7,72)	95,34 (93,88; 96,08)	0,63 (0,58; 0,66)
	Ср. за 3 часа	0,96 (0,81; 1,23)	5,49 (4,72; 6,98)	82,69 (81,85; 83,68)	0,56 (0,40; 0,67)

При анализе проб мочи, собранной за 3 часа наблюдения, различий в почечной реакции на водную нагрузку между показателями крыс 1 и 3 групп сравнения не отмечено. Так, животные этих групп экскретировали за указанный период приблизительно равный объем мочи, составивший 57-58% от объема введенной воды. Данное значение было соответственно на 31,14 и 30,36% ниже, чем у интактных крыс. Интегральным показателем, объясняющим полученные результаты, является скорость мочеотделения, которая в обеих группах оказалась достоверно ниже значений интактных животных (табл. 3).

Использование антиоксиданта «Тиофан» на фоне приема глюкокортикоидов способствовало улучшению функционального состояния почек, выражавшемуся в боле яркой реакции на нагрузочную пробу. Так, крысы 2 группы сравнения экскретировали 64,55% от объема нагрузки, а уровень диуреза в течение 3 часов наблюдения имел устойчивую тенденцию к повышению по сравнению с данными животных, получавших только глюкокортикоиды (табл. 3).

Таблица 4

Ионоуретическая функция почек крыс в покое и после водной нагрузки (Медиана (Q25;Q75)

Группы животных		uNa*v, мкмоль/100г*ч	UK*V, мкмоль/100г*ч	EF Na, %	EF к, %
Интактные	Фон	24,33 (19,91; 27,41)	33,16 (19,46; 40,93)	0,67 (0,57; 0,94)	32,14 (27,53; 33,09)
	Ср. за 3 часа	22,12 (19,57; 26,01)	16,66 (15,37; 18,83)	0,66 (0,61; 0,77)	20,67 (17,83; 22,84)
1 группа сравнения (ГКОС)	Фон	10,84* (10,25; 15,57)	28,50 (21,99; 33,81)	1,09 (0,44; 1,19)	70,01* (63,74; 108,29)
	Ср. за 3 часа	6,99* (6,03; 7,72)	18,60 (16,82; 20,35)	0,85 (0,72; 1,00)	70,09* (50,61; 90,65)
2 группа сравнения (ГКОС+Т)	Фон	10,46 (6,88; 14,30)	23,42 (18,63; 27,48)	0,67 (0,38; 0,90)	20,71** (14,67; 45,16)
	Ср. за 3 часа	12,33** (10,91; 14,70)	11,10** (9,05; 13,12)	0,56** (0,39; 0,84)	15,39** (11,60; 23,94)
3 группа сравнения (ГКОС+М)	Фон	10,52 (7,77; 11,61)	21,09 (20,65; 21,81)	1,03 (0,68; 1,27)	76,46 (63,40; 99,04)
	Ср. за 3 часа	9,60# (7,88; 10,95)	13,17 (11,01; 17,43)	1,22# (1,15; 1,41)	53,98# (39,08; 67,88)

При изучении ионоуретической функции почек у крыс первой группы сравнения отмечалось достоверное уменьшение фоновой экскреции с мочой натрия по сравнению с животными интактной группы. Аналогичная тенденция отмечалась и относительно экскреции калия. С нашей точки зрения, это изменение могло быть обусловлено как снижением фильтрационной загрузки нефронов, так и нарушением концентрационно-реабсорбционных процессов в канальцах. Необходимо отметить, что у животных первой группы сравнения достоверно увеличивалась ЕРк, что вероятно может являться результатом усиления секреции катиона при гиперкалиемии (табл. 4). Подобная тенденция отмечалась и у крыс третьей группы сравнения.

Сравнительный анализ образцов мочи крыс всех групп на содержание креатинина и мочевины позволяет считать, что уровень экскреции креатинина между группами не имеет существенных различий. Данный показатель у интактных крыс составил 47,34 (31,42; 55,52); у крыс первой группы сравнения - 56,21 (46,25;65,56); второй группы сравнения - 44,20 (33,15; 48,04); третьей группы сравнения -49,73 (39,07; 72,91) мг/100г*час. '

Как показывают результаты исследования, выведение мочевины почками у крыс, получавших только преднизолон, достоверно уменьшалось по сравнению как с интактными животными, так и с животными, принимавшими антиоксидант «Тиофан» (интактные - 8 3 3,15 (5 8 3,22; 1019,24); первая группа сравнения -517,25 (338,27; 525,69); вторая группа сравнения - 756,18 (605,61; 817,07); третья группа сравнения - 550,57 (447,26; 703,36) мг/100г*час).

Обнаруженные нарушения гидро- и ионоуретической функций почек, а также и изменение ионо-осмотических показателей плазмы крови у животных, длительно получавших глюкокортикоиды, могут объясняться повреждением клеток и межклеточного вещества паренхимы почек преимущественно активными метаболитами кислорода при окислительном стрессе. Значительная роль свободнорадикальных процессов в развитии нефропатии подтверждается коррекцией гомеостатических показателей плазмы крови и функционального состояния почек при использовании антиоксидантного соединения.

Заключение. Полученные результаты работы дают основание заключить, что при глюкокортикоид-индуцированном окислительном стрессе происходит нарушение гидро- и ионоуретической функций почек, выражающееся в снижении скорости клубочковой фильтрации, относительной реабсорбции жидкости, уменьшении экскреции мочевины, ионов натрия и калия, а также отсутствии выраженной реакции на 5% водную нагрузку.

Вследствие снижения функциональных возможностей почек при длительном использовании глюкокортикоидов у крыс регистрируются гиперкалиемия, гиперкреатинемия и гиперуринемия, которые отражают развитие почечной недостаточности.

Луканина С.Н. Особенности гидро- и ионоуретической функций почек крыс при окислительном стрессе / С.Н. Луканина, А.В, Сахаров, А.Е. Просенко, К.В. Жучаев // Вести. ТвГУ. Сер.: Биология и экология. 2017. № 1. С. 18-27.