Polymorphism of the interleukin-18 gene in pregnant women with preterm birth

Актуальность

Сохраняющаяся на высоком уровне частота осложнений беременности, в генезе которых значительная роль принадлежит воспалительному компоненту, диктует необходимость поиска новых технологий в предикции данных состояний. К одному из наиболее грозных осложнений беременности относится преждевременный разрыв плодных оболочек (ПРПО) при недоношенной беременности.

Фетоплацентарная система является неотъемлемым звеном в генерировании как физиологически протекающих процессов при беременности, так и в развитии гестационных осложнений. Известно, что немаловажная роль в генезе ПРПО принадлежит наследственным факторам. Генный полиморфизм факторов, формирующих фетоплацентарную систему, в ряде случаев определяет особенности функционирования этой системы [1].

В норме при беременности соблюдается оптимальное равновесие провоспалительных (вырабатываемых Th1-клетками) и противовоспалительных (вырабаты-

ваемых Th2-клетками) цитокинов в фетоплацентарном комплексе [2].

Иммунологические нарушения, возникающие при ПРПО, могут быть обусловлены особенностями генотипа, в том числе и по генам цитокинов, которые кодируют молекулы эндогенных медиаторов межклеточных взаимодействий. Дисрегуляция в каскадных механизмах работы цитокинов, обусловленная, в том числе и особенностями генотипа, может приводить к формированию неблагоприятных для развития беременности условий [3].

Уровень экспрессии провоспалительных цитокинов во многом определяется генетически. В связи с этим, изучение полиморфной структуры цитокиновой сети, расшифровка механизмов регуляции функциональной активности клеток иммунной системы и генетического контроля иммунного ответа может приблизить нас к решению проблемы предикции осложнений беременности, ассоциированных с воспалительным фактором.

Для многих генов про- и противовоспалительных цитокинов известны замены одиночных нуклеотидов (SNP, от англ. Single Nucleotide Polymorphism), которые располагаются в регуляторных участках генов и оказывают влияние на транскрипторную активность, соответственно увеличивая или уменьшая уровень цитокина в плазме крови [4; 5; 6].

Интерлейкин-18 (ИЛ-18) является одним из основных иммунорегулирующих цитокинов, участвующих в противовоспалительной защите организма. ИЛ-18 стимулирует продукцию ИФ γ , ФНО α , ИЛ-1, ИЛ-2, молекул адгезии и факторов апоптоза, увеличивает пролиферативную активность Т-лимфоцитов, повышает литическую активность НК-клеток. Таким образом, ИЛ-18 участвует в формировании клеточного и гуморального, врожденного и приобретенного иммунного ответов [7]. У человека ген IL18 расположен в хромосоме 11q22.2-g22.3.

Цель исследования : изучить влияние полиморфных вариантов - 137G>C (rs187238), - 607G>T (rs1946518), - 656A>C (rs5744228) промотора гена IL18 в развитии ПРПО в сроке гестации 22–27,6 недель.

Материалы и методы

В исследование было включено 45 беременных женщин, которые находились на обследовании и лечении в ГБУ РО «Перинатальный центр».

Все женщины были разделены на 2 группы: в 1-ю группу вошла 31 пациентка с ПРПО в сроки 22-27,6 недель, 2-ю (контрольную) группу составили 14 женщин с клинически нормально протекающей беременностью в аналогичные сроки.

Всем беременным было проведено генотипирование полиморфных локусов гена интерлейкина -18: IL18 -137G>C, -607G>T, -656A>C , а также определение концентрации IL-18 в периферической крови.

Забор крови у пациенток 1-й группы осуществлялся при поступлении в отделение патологии беременных ГБУ РО ПЦ до начала антибактериальной терапии, у пациен- ток 2-й группы - на амбулаторном этапе в эквивалентные сроки беременности.

Образцы крови, забранные в вакуумные пробирки с активатором свертывания, центрифугировали, полученную сыворотку аликвотировали и хранили при -70 °C. После однократного размораживания методом иммуноферментного анализа определяли концентрацию IL-18 в сыворотке крови коммерческими наборами (АО «Вектор Бест», Россия) с использованием анализатора Wallac 1420 Multilaber Counter (Victor-2) («PerkinElmer», Финляндия).

Выделение геномной ДНК из периферической венозной крови, стабилизированной ЭДТА, проводили с помощью комплекта реагентов «ПРОБА–ГС–ПЛЮС» («ДНК-Технология», Россия). Коммерческими наборами («ДНК-Технология», Россия) определяли однонуклеотидные замены: - 137G>C (rs187238), - 607G>T (rs1946518), - 656A>C (rs5744228) гена IL18 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с помощью детектирующего амплификатора «ДТлайт» («ДНК-Технология», Россия).

У всех пациентов предварительно было получено информированное согласие на проведение данного исследования.

Средний возраст беременных в 1-й группе составил 31,0±4,84 год, в группе контроля 29,2±4,56 лет (U-критерий Манна-Уитни р>0,05), группы сопоставимы. Беременные обеих клинических групп были сопоставимы по акушерскому анамнезу. Из исследования были исключены случаи многоплодной беременности, хромосомной патологии, врожденных пороков развития у плода, а также беременность после вспомогательных репродуктивных технологий.

Результаты

В результате исследования установлено, что у беременных с ПРПО (1-я группа) отмечалось статистически значимое повышение уровня ИЛ-18 в сыворотке крови по сравнению с уровнем данного цитокина у беременных 2-й группы (271±63,1 против 116±10,6, р = 0,0001) (табл. 1).

Нами был проведен анализ распределения частот аллелей (табл. 2) и генотипов (табл. 3) по SNP гена интерлейкина 18: - 137G>C (rs187238), - 607G>T (rs1946518), - 656A>C (rs5744228) у 31 женщины в основной группе (1-я) и у 14 женщин группы контроля (2-я группа).

Распределение частот генотипов для полиморфных локусов - 137G>C (rs187238) и - 656A>C (rs5744228) гена

Табл. 1. Уровень интерлейкина-18 в периферической крови беременных с ПРПО и в контрольной группе

Уровень цитокина в периферической крови	1 группа (n = 31)	2 группа (n = 14)	Р-value
ИЛ-18, пг/мл	271±63,1	116±10,6	0,0001

Примечание : сравнение в группах осуществлялось с помощью критерия Манна-Уитни.

Табл. 2. Частота аллелей по SNP гена интерлейкина-18 ( -137G>C (rs187238), -607G>T (rs1946518), -656A>C (rs5744228)) у беременных с ПРПО и в контрольной группе

Ген, SNP, аллель	Группа 1 (n = 31)	Группа 2 (n = 14)	Р-value
Полиморфный локус -137G>C (rs187238)
G	0,18	0,18	0,99
C	0,82	0,82
Полиморфный локус -656A>C (rs5744228)
А	0,71	0,96	0,014
С	0,29	0,04
Полиморфный локус -607G>T (rs1946518)
G	0,26	0,07	0,08
T	0,74	0,93

Примечание : сравнение групп по частоте встречаемости аллели осуществлялось с помощью точного теста Фишера.

IL18 в обеих исследуемых группах женщин соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. Для частот генотипов по SNP - 607G>T (rs1946518) равновесие Харди-Вайнберга не соблюдается.

Характер распределение частот аллелей полиморфного локуса - 137G>С гена IL18 одинаков в двух группах женщин, включенных в исследование. Однако, выявлено значимое отличие в распределении частот аллелей полиморфизма - 656A>C гена IL18 (табл. 2).

Так, в 1-й группе женщин частота встречаемости аллели - 656C гена IL18 составила 0,29, что статистически значимо выше по сравнению с частотой аллели - 656C в группе 2 (р = 0,014), (табл. 2). Наличие однонуклеотидной замены в промоторном участке может изменять эффективность транскрипции гена, что приводит к изменению уровня продукции интерлейкина-18.

Как видно из таблицы 3 распределение частот генотипов по исследуемому полиморфизму - 656А>С гена IL18 среди женщин двух групп, включенных в исследование, статистически значимо отличаются.

В группе контроля гомозиготами по аллели - 656А гена IL18 являлись 92,9% женщин. В группе женщин с преждевременным разрывом плодных оболочек число гомозигот - 656АА гена IL18 составило 51,6%, а доля гетерозигот по полиморфизму - 656А>С выше по сравнению со 2-й группой (38,7 % против 7,1%). Для гомозигот - 656АА гена IL18 выявлено снижение риска развития ПРПО [(OR = 0,08 (95% CI 0,01-0,706)].

Обсуждение полученных результатов

Иммунный ответ имеет индивидуальные особенности у каждого из индивидуумов, при встрече с патологическими агентами может включаться как гуморальный, так и клеточный иммунитет, что имеет большое значение в реализации воспалительного процесса и защите макроорганизма в целом.

Как мы знаем, физиологически протекающая беременность сопровождается реализацией провос-палительных и противовоспалительных цитокинов в фетоплацентарной области.

Табл. 3. Частота генотипов по полиморфным вариантам гена интерлейкина-18 ( -137G>C (rs187238), -607G>T (rs1946518), -656A>C (rs5744228)) у беременных с ПРПО и в контрольной группе

Ген, SNP, генотип	Группа 1 (n = 31) Группа 2 (n = 14)		Р-value
Полиморфный локус -137G>C (rs187238)
GG	0 (0%)	0 (0%)	0,99
GC	11 (35,5%)	5 (35,7%)
CC	20 (64,5%)	9 (64,3%)
Полиморфный локус -656A>C (rs5744228)
AA	16 (51,6)	13 (92,9%)	0,027
AC	12 (38,7%)	1 (7,1%)
CC	3 (9,7%)	0 (0%)
Полиморфный локус -607G>T (rs1946518)
GG	5 (16,2%)	1 (7,1%)	0,069
GT	6 (19,3%)	0 (0%)
TT	20 (64,5%)	13 (92,9%)

Примечание : сравнение групп по частоте встречаемости генотипа осуществлялось с помощью точного теста Фишера.

Цитокины являются биологически-активными эндогенными медиаторами, обеспечивающими обмен информацией между различными клетками внутри одного органа и формировании связи между органами и системами, как в физиологических условиях, так и при воздействии патогенных факторов [7].

При патологических состояниях уровень цитокинов резко возрастает, тогда как для реализации биологических эффектов при нормально протекающей беременности их выработка происходит в минимальных количествах.

Согласно данным литературы различия в генах, контролирующих защитные реакции организма, могут оказывать влияние на уровень продукции цитокинов и, в свою очередь, на развитие и реализацию иммунного ответа.

Анализ на полиморфизм генов цитокинов – это молекулярно-генетическое исследование, которое позволяет обнаружить носительство у пациентки аллельных вариантов генов, при наличии которых возможно изменение уровня цитокинов.

Отдельные аллельные варианты генов цитокинов могут быть ассоциированы с изменением синтеза соответствующего белкового продукта, что также оказывает влияние на характер течения, возникновение определенных осложнений заболевания.

Так, в нашем исследовании при изучении уровня интерлейкина-18 в сыворотке крови пациенток с преждевременным разрывом плодных оболочек отмечалось статистически значимое увеличение концентрации белка по сравнению с пациентками из группы контроля (271±63,1 против 116±10,6, р = 0,0001).

Важно отметить, что в функционально-активных участках промотора гена ИЛ-18 обнаружено несколько одиночных нуклеотидных замен, которые могут влиять на продукцию ИЛ-18. Поэтому уровень продукции ИЛ-18 может быть обусловлен генетическими механизмами [8].

Изучив частоту встречаемости аллелей и генотипов полиморфных локусов гена интерлейкина-18, нами были выявлены значимые отличия по полиморфизму - 656A>C гена IL18 . Среди женщин 1-й группы (ПРПО) частота встречаемости мутантной аллели - 656С статистически значимо выше по сравнению с группой 2 (контроль) (р = 0,014). Генотип - 656CC полиморфизма гена IL18 является генотипом высокого риска для развития ПРПО.

Выявленные в нашем исследовании отличия в частотах аллелей и генотипов по гену цитокина ИЛ-18 между группами женщин с ПРПО и нормально протекающей беременностью предполагают изменения в определенных звеньях цитокинового каскада. Можно предположить, что первичным звеном в нарушении нормального баланса цитокинов может выступать нарушение уровня экспрессии белка (а именно ИЛ-18) ввиду носительства мутантного варианта гена.

Согласно Цитокиновой теории заболеваний состояние здоровья и благополучия в организме в целом характеризуется постоянной сбалансированной продукцией цитокинов на низком уровне, что необходимо для поддержания гомеостаза. В свою очередь при сверхпродукции некоторых цитокинов могут возникать различные патологические состояния и заболевания, тяжесть которых варьирует от легкой до фатальной [7; 9; 10].

Таким образом, крайне важно определение наследственной генетической предрасположенности для понимания молекулярных механизмов развития воспалительных реакций в организме.

Выводы

Данные нашего исследования показали вероятную связь полиморфизма - 656A>C гена IL18 с развитием ПРПО. Выявление носительства указанного полиморфного варианта гена у женщин в группе риска по развитию ПРПО может служить в качестве предиктивного маркера, что позволит своевременно наметить тактику ведения беременности и разработать профилактические мероприятия.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов (The authors declare no conflict of interest).