Условия эффективного подавления ПЦР с помощью LNA-олигонуклеотидов для простой и высокочувствительной детекции соматических мутаций

Специфическое блокирование амплификации аллеля дикого типа в ПцР с помощью олигонуклеотидов, модифицированных по остатку рибозы (закрытые нуклеиновые кислоты, locked nucleic acids, LNA), используется для высокочувствительной детекции соматических мутаций в опухолях. Описаны различные версии метода анализа мутаций с использованием LNA-олигонуклеотидов как с дополнительной модификацией фосфотиоатными группами, так и без таких групп, при этом использовались различные ДНК полимеразы. В работе проведен анализ оптимальных условий для успешного специфического блокирования ПцР с помощью LNA-олигонуклеотидов при анализе мутаций в генах KRAS и bRAF. Мы обнаружили, что фосфотиоатная защита на 5’-конце олигонуклеотидов не влияет на эффективность блокирования аллеля дикого типа. Выявлено, что для большинства последовательностей эффективное блокирование наблюдается при проведении шага отжига и элонгации ПцР при температуре на 20-25°С ниже температуры плавления LNA-олигонуклеотида. При таких условиях реакции возможна простая и высокочувствительная детекция мутаций в генах KRAS и bRAF с использованием как секвенирования по Сэнгеру, так и ПцР в реальном времени с Taqman зондами.