The toxicity of lanthanum and cerium in conditions of biotest with Allium cepa

Лантан и церий являются представителями группы редкоземельных элементов (РЗЭ) – металлов, вошедших в список сырьевых материалов, критически важных для новых технологий раз- личных отраслей производства по решению Европейской комиссии 2010 г. (Catinat, 2010). La и Ce – наиболее распространенные элементы группы РЗЭ, значения их кларковых чисел находятся в диапазонах 30–35 и 64–66 мг/кг соответственно (Castor, Hedrick, 2006; Tyler, 2004). Активная добыча, использование, образование и неправильная утилизация отходов, содержащих РЗЭ, могут приводить к увеличению концентрации этих элементов в окружающей среде, что было показано в ряде работ (Anawar et al., 2012; Kulaksız, Bau, 2011). Источником РЗЭ в агроэкосистемах, помимо промышленности, являются подстилающие породы почв, органические и минеральные (особенно фосфорные) удобрения, в которых РЗЭ могут содержаться в большом количестве (Hu et al., 2006; Pang et al., 2002; Sadeghi et al., 2013; von Tucher, Schmidhalter, 2005). Также металлы группы РЗЭ нашли применение в сельском хозяйстве в виде микроудобрений, которые становятся дополнительным источником загрязнения и обусловливают повышенные уровни содержания этих элементов в почве и сопредельных средах (Liang et al., 2005).

Обнаружение этих металлов в сточных водах и водных экосистемах, аккумуляцию их в почве и выращиваемой на ней продукции, а также в образцах человеческих волос связывают с последствиями индустриальной деятельности и сельскохозяйственных практик (Gonzalez et al., 2014; González et al., 2015) . Присутствие РЗЭ в этих и других объектах в концентрации, превышающей фоновую, обусловливает необходимость оценки их влияния на живые организмы.

Необходимо принимать во внимание, что оценка возможного влияния веществ на окружающую среду и обитающую в ней биоту только по их содержанию и соответствию санитарногигиеническим нормативам, не всегда учитывает риски особо опасных и комбинированных форм токсического воздействия. Поскольку нормативы разработаны далеко не для всех загрязнителей, такая оценка является недостаточной и требует применения биотестов, способных отразить возможное специфическое и комплексное воздействие на живые организмы. Также тест-системы необходимо использовать при оценке возможности применения новых веществ в сельском хозяйстве, изучении влияния их различной концентрации. При этом исследования, посвященные во-

Бюллетень Почвенного института им. В.В. Докучаева. 2017. Вып. 89 просу токсичности РЗЭ, остаются немногочисленными и противоречивыми, что во многом может объясняться различием использованной концентрации элементов, тест-объектов и схемами постановки экспериментов (Gonzalez et al., 2014; Hu et al., 2004) .

Нужно отметить, что значимыми в оценке токсичности методами биотестирования тех или иных факторов загрязнения являются не только ростовые и биохимические показатели тест-организмов. Существенна и активность факторов по отношению к генетическому аппарату клеток в связи с возможной передачей нарушений последующим поколениям организмов с наследственным материалом или развитием патологий в онтогенезе организма. Для решения этой задачи широко применяется тест-система с луком репчатым Allium cepa L., позволяющая учитывать нарушения в процессе деления клеток апикальной меристемы корня, наряду с измерением общей токсичности по изменению ростовых показателей (Fiskesjö, 1985) . Данный тест-объект хорошо изучен цитологически и показал свою перспективность для оценки цитотоксичности различных химических факторов (Leme, Marin- Morales, 2009) . Необходимость исследования влияния La и Ce на процесс клеточного деления подтверждается данными работ, выявивших активность представителей РЗЭ в этом отношении с применением других видов растений (d’Aquino et al., 2009; de Oliveira et al., 2015; Xu et al., 2016) . Однако предыдущие исследований не позволяют сделать однозначных выводов о воздействии РЗЭ на активность деления клеток и об индуцировании ими нарушений митотического цикла, так как результаты довольно противоречивы. Поэтому целью настоящей работы стала оценка токсичности растворов солей La и Ce в условиях биотеста с Allium cepa .

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Тестирование растворов хлорида лантана и церия проводили с применением Allium-теста, согласно существующей методике без предварительного проращивания луковиц (Ateeq et al., 2002; Fiskesjö, 1988) . Луковицы Allium cepa L. сорта «Штутгартен» откалиброванные по размеру (1.5–2 см в диаметре) помещали для проращивания в емкости, наполненные растворами LaСl 3 следующих концентраций: 0 (контроль, дистиллированная вода), 10, 20, 50, 100 и 200 мг/л. Предварительные эксперименты показали

Бюллетень Почвенного института им. В.В. Докучаева. 2017. Вып. 89 бόльшую токсичность хлорида церия в этих концентрациях по сравнению с хлоридом лантана, не позволяющую получить материал для цитологического исследования, поэтому было решено проводить тестирование растворов CeСl 3 следующих концентраций: 0, 2, 5, 10, 20 и 50 мг/л.

Каждую концентрацию тестировали в пяти повторностях (луковицах) единовременно. Проращивание луковиц производили при температуре 20–25°C в течение 120 ч в темноте. После проращивания полученный материал фиксировали в смеси 96%-ного этилового спирта и ледяной уксусной кислоты 3 : 1 (фиксатор Кларка): кончики корней длиной около 1 см отрезали и помещали в раствор на 24 ч. Затем материал переводили на долговременное хранение в 70%-ный раствор этилового спирта. На стадии фиксации и при долговременном хранении материал хранили в холодильнике при температуре +4°C. Также проводили измерение длины самого длинного корня у каждой луковицы.

Для подготовки к микроскопированию зафиксированные корни отмывали в дистиллированной воде и проводили окрашивание 2%-ным ацетоорсеином (Паушева, 1988) . В давленых препаратах учитывали не менее 3000 клеток, имеющих хорошо прокрашенные ядра и клеточные стенки без повреждений, для каждой исследуемой повторности, таким образом, анализировали порядка 15 000 клеток для каждой тестируемой концентрации. Учитывали общее количество клеток и отдельно делящихся клеток по стадиям митоза: в профазе, метафазе, анафазе и телофазе, а также клетки, имеющие патологии митоза. Митотический индекс ( МИ ) рассчитывали по формуле (Sehgal et al., 2006) :

(П + М + A + Т) ми, % = ----------100, где МИ – митотический индекс, (П + М + А + Т) – сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, анафазы и телофазы соответственно, N – общее количество клеток. Частоту патологий митоза рассчитывали соответственно как отношение числа клеток с нарушениями митоза к общему числу делящихся клеток (Концевая, Толкачева, 2012). Препараты апикальной меристемы корней лука анализировали с использованием светового микроскопа Микмед-6 («ЛОМО», Россия).

Статистический анализ полученных данных проводили на уровне значимости 0.05 в программах Statistica 12 и R с применением рангового дисперсионного анализа Крускала–Уоллиса (Kruskal, Wallis, 1952) . В случае выявления значимых различий объединенные ранги далее использовали для множественных сравнений экспериментальных вариантов с контролем при помощи теста Гао (Gao et al., 2008; Konietschke et al., 2015) . Для графического представления результатов по каждому варианту рассчитывали 95%-ные доверительные интервалы для средних при помощи t -критерия. Корреляции оценивали при помощи коэффициентов корреляции Пирсона ( R ) и Спирмена ( S ).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Статистический анализ результатов измерения длины пророщенных корней показал значимое уменьшение этого показателя по сравнению с контрольным вариантом опыта, начиная с концентрации 50 мг/л и выше, при тестировании растворов хлорида лантана (рис. 1). Для растворов хлорида церия этот эффект был показан начиная с наименьшей тестируемой концентрации 2 мг/л и выше.

Результаты цитологического анализа клеток апикальной меристемы корней лука, пророщенного на растворах хлорида лантана, показали статистически достоверное уменьшение значений МИ относительно контрольного опыта для всех исследованных вариантов (рис. 2). Для протестированных растворов хлорида церия достоверное снижение активности деления клеток показано, начиная с концентрации 5 мг/л Ce в растворе и выше.

При этом достоверное увеличение показателя частоты встречаемости патологий митоза отмечается при тестировании концентрации 50 мг/л растворов обеих солей (рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты исследования показали значительное ингибирование роста корня при тестировании растворов солей La и Ce. Отмечаемое снижение длины корня уже при самой низкой тестируемой концентрации Ce 2 мг/л может говорить о высокой токсичности изучаемого элемента в данных условиях. Снижение длины кор-

Концентрация Се, мг/л

Рис. 1. Длина пророщенных корней Allium cepa в зависимости от концентрации La и Ce в растворе; вертикальными линиями обозначены 95%-ные доверительные интервалы, звездочками – значимые различия с контрольным вариантом.

ня при обработке наименьшей концентрацией La (10 мг/л) также наблюдалось, но не достигало статистической значимости.

Редкоземельные элементы способны в значительной степени накапливаться корнями растений (Wang et al., 2011a) , однако задерживаются поясками Каспари (Nagahashi et al., 1974) . Лантан и церий при этом оказывают негативное влияние на рост корня (Diatloff et al., 1995) . Токсичность, оказываемая лантаном на клетки корня, может проявляться в виде нарушений перекисного окис-

Концентрация Се, мг/л

Рис. 2. Митотический индекс (МИ) в апикальной меристеме корней Allium cepa в зависимости от концентрации La и Ce в растворе; вертикальными линиями обозначены 95%-ные доверительные интервалы, звездочками – значимые различия с контрольным вариантом.

ления липидов, активности поглощения кислорода, а также активности H⁺-АТФазы и Ca²⁺-АТФазы в плазматических мембранах клеток корешков, притом нарушение активности Ca²⁺-АТФазы в клетках корешков наблюдали уже при 0.3 мг/л La. Возможно, эти процессы, а также вызванное La и Ce повышение содержания активных форм кислорода (Wang et al., 2011b) способны объяснить обнаруженное нами цито- и генотоксическое действие церия, схожее с действием лантана. Тем не менее, несмотря на статистическую достоверность нашего исследования и данные ряда других

Рис. 3. Частота патологий митоза (ПМ) в апикальной меристеме корней Allium cepa в зависимости от концентрации La и Ce растворе; вертикальными линиями обозначены 95%-ные доверительные интервалы, звездочками – значимые различия с контрольным вариантом.

работ, в большом количестве других исследований отмечали гор-метический эффект, т.е. положительное действие РЗЭ на корни при низких концентрациях (Fashui et al., 2003; Li et al., 2007; Song et al., 2002; Wang et al., 2011a; Xu et al., 2007) .

Возможная активность РЗЭ в отношении процессов клеточного деления остается мало проработанным вопросом. Результаты исследования, проведенного с проростками бобов (Vicia faba L.), показывают индуцированные лантаном повреждения в ДНК, ко- торые могли послужить причиной замедления роста корней, совместно с дисбалансом элементов питания, при тестировании La в концентрации свыше 2 мг/л (Wang et al., 2012). Отмечаемое нами по результатам цитологического анализа достоверное уменьшение МИ может говорить о потенциальной митотоксичности солей La и Ce в исследованных концентрациях. Это согласуется с данными исследования, проведенного на растениях пшеницы (Triticum durum), где показано дозозависимое уменьшение МИ при концентрации нитрата лантана 1.4–1400 мг/л (d’Aquino et al., 2009). Важно отметить схожесть наших результатов с полученными на более близком к использованному репчатому луку объекте биотестирования – чесноке (Allium sativum) (Xu et al., 2016). Авторами показано постепенное уменьшение митотической активности клеток апикальной меристемы при тестировании питательных растворов с концентрацией Ce от 0.05 до 56 мг/л.

Противоположные результаты получены в работе (de Oliveira et al., 2015) , где показано увеличение пролиферативной активности клеток кончиков корешков сои после проращивания в течение 28 дней при концентрации лантана в питательном растворе 2.8–22.2 мг/л. Несоответствие полученных данных может объясняться видоспецифичной реакцией тест-объектов на РЗЭ, что говорит о необходимости использования различных тест-систем, широкий спектр которых способен наиболее полно отразить характер воздействия исследуемых веществ на организмы.

Обычно снижение пролиферативной активности связывают с увеличением частоты встречаемости клеток с различными патологиями деления (d’Aquino et al., 2009; Qin et al., 2015) , переход которых в последующие стадии митоза оказывается затруднен. Увеличение патологий митоза при концентрации хлоридов лантана и церия в растворе 50 мг/л на фоне снижения МИ, а также наличие отрицательной корреляции между этими показателями ( R = –0.41 и S = –0.32) и положительной между МИ и длиной корня ( R = 0.68 и S = 0.69) позволяет предположить, что рост частоты встречаемости клеток с патологиями деления является причиной уменьшения длины корня с увеличением содержания внесенных РЗЭ. При этом необходимо принимать во внимание, что количество клеток с нарушениями митоза при тестировании растворов с высокой концентрацией может быть недооцененным в связи с об-

Бюллетень Почвенного института им. В.В. Докучаева. 2017. Вып. 89 щим уменьшением числа делящихся клеток и возможным недоучетом числа клеток с аномалиями.

Данные работы, проведенной в Оренбургской области, согласуются с нашими результатами и показывают прямую корреляционную связь обнаруженных при тестировании с Allium cepa хромосомных аберраций и индексом нагрузки РЗЭ для водоемов и водотоков, среднее значение которого колебалось от 7.3 × 10^-4 до 1 × 10^-2 мг/л (Соловых и др., 2012) . Однако необходимо отметить, что показанное авторами наличие корреляции не доказывает мутагенность именно РЗЭ в изучаемых пробах донных отложений, так как исследование проводилось на нативных образцах, которые могли быть загрязнены и другими токсикантами, содержание которых не изучалось.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показанное с применение тест-системы с Allium cepa значительное негативное изменение в ростовых показателях корня свидетельствует о токсичности La и Ce в изученных концентрациях. Причиной ингибирования процесса роста корня, судя по всему, является снижение активности деления клеток, т.е. митотоксич-ность протестированных растворов хлоридов лантана и церия. Отмечаемое увеличение частоты встречаемости клеток с патологиями митоза в свою очередь может объяснять снижение пролиферации и указывать на генотоксичность тестируемых элементов.

Некоторые противоречия полученных данных с рядом других современных исследований, очевидно, должны послужить причиной для продолжения работы над изучением воздействия РЗЭ на растения. При этом требуется привлечение других тест-объектов и расширения диапазона тестируемых концентраций элементов.

Полученные данные могут быть полезны для токсикологической оценки La и Ce.

Kontsevaya I., Tolkacheva T. Perfection of the method of biotesting on the basis of the Allium-test, Vesnіk Vіtsebskaga dzyarzhaўnaga ўніверсітэта. 2012. No. 6 (72). pp. 57–65. (in Russian)

Pausheva Z.P. Workshop on plant cytology . Moscow: Agropromizdat, 1988. 271 p. (in Russian)