Аберрантное метилирование промоторных участков генов APC, CDH13 И MGMT у больных колоректальным раком

Колоректальный рак (КРР) – гетерогенное злокачественное новообразование, занимающее третье место в мире в структуре заболеваемости и смертности среди других злокачественных опухолей [2]. В 1988 г. B. Vogelstein et al. предложили первую линейную модель онкогенеза толстой и прямой кишки [22] на базе исторически сложившихся представлений о процессе малигнизации тканей как накоплении в клетке событий хромосомной нестабильности и мутаций в онкогенах и генах-супрессорах. В последующие десятилетия после серьёзных успехов в исследовании микроса-теллитной нестабильности (MSI) и метилирования генома были описаны несколько альтернативных цепочек молекулярных событий при развитии КРР [7]. Основными маркерами предложенной классификации КРР, объединяющей аберрантные структурные и молекулярные изменения, стали взаимоисключающие активирующие мутации в генах KRAS и BRAF, инактивирующие мутации в гене – онко-супрессоре АРС, MSI и статус метилирования генома в целом, и генов MLH1 и MGMT, в частности [10, 17]. Кроме определения клинико-морфологических особенностей, понимание роли генетических и эпигенетических изменений в патогенезе КРР даёт информацию для разработки новых биомаркеров эффективного профилактического скрининга, выбора таргетной терапии, прогнозирования течения заболевания и ответа на лечение.

Метилирование обширных регионов CpG-островков (так называемый фенотип метилированных CpG островков или CIMP) – основное эпигенетическое изменение, описанное в колоректальных неопластических образованиях. Частота обнаружения CIMP в случаях спорадического КРР, по разным оценкам, колеблется от 15 до 50 % [12].

APC , CDH13 и MGMT – гены-онкосупрессоры, транскрипция которых часто подавляется в опухолях человека посредством аберрантного метилирования промоторных участков [4, 12, 13], что функционально эквивалентно инактивирующей мутации [6]. Однако большая часть данных по этим и другим генам была получена с помощью метода аллель-специфичной PCR (MSP), обладающего рядом методических ограничений [14]. Например, в случае использования метода MSP затруднительно идентифицировать фоновый уровень метилирования, так как даже в условно нормальной ткани может отмечаться негативная эпигенетическая регуляция активности генов-онкосупресоров, связанная, например, с возрастом [9, 16].

Цель исследования – количественный анализ CpG-метилирования промоторных участков

генов-онкосупрессоров APC , CDH13 и MGMT в операционных биоптатах условно нормальной и опухолевой ткани толстой кишки в сочетании с идентификацией активирующих SNP-мутаций в генах KRAS , NRAS , BRAF .

Материал и методы

В исследование были включены 25 пациентов с умеренно (G 2 ) и низкодифференцированным (G 3 ) раком толстой кишки (табл. 1), проходивших стационарное лечение в ФГБУ РНИОИ в 2013–14 гг. Медиана возраста составила 59 лет. Каждый пациент подписал добровольное информированное согласие на участие в проведении исследования.

Тотальную ДНК из опухолевых и условно здоровых тканей выделяли методом фенолхлороформной экстракции [1]. Бисульфитное конвертирование ДНК проводили согласно протоколу, предложенному K. Patterson et al. [18] в собственной модификации: для удаления бисульфит-ионов использовали набор очистки ДНК из реакционных смесей (BioSilica, Россия). Количественное метилирование 42 CpG-сайтов трёх генов (APC, CDH13 и MGMT) оценивали методом пиросеквенирования с использованием системы генетического анализа PyroMark Q24 (Qiagen, Germany). По результатам пробных экспериментов для наработки ампликонов и собственно пиросеквенирования были выбраны праймеры (табл. 2). Ампликоны, полученные после постановки ПЦР на матрице бисульфит-конвертированной ДНК, подвергали очистке, денатурации и отмывке с последующим отжигом с секвенирующим праймером при 80°С и постановкой реакции пиросеквенирования. Постановку пиросеквенирования каждого образца проводили, как минимум, в двух повторах. Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения PyroMark Q24 Software (Qiagen, Germany). Значение метилирования отдельного CpG-сайта, рассчитанного как отношение содержания нуклеотидов С/Т (рис. 1), использовали для вычисления усредненного метилирования промоторного участка каждого гена (Met, %).

Методом прямого секвенирования по Сэнгеру (АВ3500, LifeTechnologies, USA) идентифицировали мутации во 2, 3 и 4-м экзонах генов KRAS и NRAS . В настоящее время скрининг наличия мутаций не только в гене KRAS , но и NRAS становится обязательным для характеристики КРР-опухолей в целях определения стратегии лечения с использованием таргетных препаратов [20]. Скрининг мутации V600E в гене BRAF осуществляли с

Рис. 1. Пример пирограмм промоторной последовательности гена АРС , полученных с помощью секвенирующего праймера Ру1 для образцов условно нормальной (вверху) и опухолевой (внизу) ткани. Значения соотношения С/Т указаны в процентах над каждым анализируемым CpG-сайтом

таблица 1

клинико-морфологическая характеристика пациентов

Параметры Количество больных T3N0M0 5 (20 %) Стадия опухоли T3-4N1M0 12 (48 %) T3 4N 2M 8 (32 %) Гистологический тип опухоли Аденокарцинома 24 (96 %) Слизистый рак 1 (4 %) G2 22 (88 %) Дифференцировка опухоли G3 3 (12 %) Пол Женщины 13 (52 %) Мужчины 12 (48 %) <55 10 (40 %) Возраст, лет >55 15 (60 %) использованием набора «Real-Time-PCR-BRAF V600E» («Биолинк», Россия).

Медиана, вариация, U-критерий Манна – Уитни и статистическая достоверность различий были вычислены для каждого CpG-сайта, а также в среднем по множеству CpG-сайтов каждого гена. Достоверность различий по частотным показателям определяли, используя х2-тест. Все расчёты проведены с помощью программы Statistica v. 7.0 (Stat Soft Inc, 2004).

Результаты и обсуждение

Типичные пирограммы секвенс-анализа бисульфит-конвертированной ДНК, выделенной из условно нормальной и опухолевой тканей больных КРР, продемонстрированы на рисунке. Оценка метилирования по отдельным CpG-сайтам выявила неэффективность этого показателя в 10 CpG сайте ампликона APC/Py1 (крайний справа на рисунке) и 12 CpG сайте ампликона MGMT/Re2 ввиду регистрации низкого уровня метилирования во всех пробах (медиана - 19 и 13 % соответственно), что обусловило отсутствие достоверных различий между опухолевой и условно нормальной тканью.

Усредненные данные по уровню метилирования (Меt, %) промоторных участков каждого гена представлены в табл. 3. Во всех образцах условно нормальной ткани был зарегистрирован «фоновый» уровень Меt промоторных участков трёх генов. Сравнительный анализ образцов опухолевой и условно нормальной тканей выявил достоверное повышение тотального показателя уровня Меt в тканях КРР для генов MGMT (p=0,016) и CDH13 (p<0,001). Однако опухолевые образцы продемонстрировали высокую гетерогенность по данному показателю: по каждому из исследованных генов были зафиксированы случаи как гипер-, так и гипо-метилирования. Для отражения этого факта мы классифицировали выборку на подгруппы: условно нормальная ткань (N), колоректальные опухоли в целом (CRC), опухоли с повышенным уровнем метилирования по сравнению с нормой

(CRC-Меt_H), опухоли, не отличающиеся от нормы (CRC-Меt_L). Метилирование промоторных участков генов в подгруппе CRC-Меt_Н было статистически достоверно выше, чем в подгруппах N и CRC-Меt_L по всем генам (p<0,001). Согласно значениям интерквартильного интервала в CRC-Меt_Н наблюдали и более высокое варьирование показателей уровня Меt.

Гиперметилирование промоторного участка гена CDH13 фиксировали в 58 % случаев, тогда как группы CRC-Меt_Н по двум другим генам ( APC и MGMT) насчитывали по 40 % от объёма исследованной выборки (табл. 3). Двадцать (80 %) образцов опухолей КРР из всего проанализированного нами массива данных продемонстрировали CpG-гиперметилирование хотя бы по одному гену, из них 4 (16 %) были гиперметилированы по всем трём генам.

Статус метилирования генов MGMT , APC , CDH13 при КРР был исследован ранее [12]. Однако все подобные исследования были выполнены с использованием метода MSP, что исключает прямое сравнение c нашими данными. Возможно, что в силу определенных ограничений MSP, позволяющего провести только качественную оценку CpG-сайтов по принципу высокого, среднего и низкого уровня метилирования, в работах по исследованию КРР представлены весьма разнородные данные частоты гиперметилирования генов. Например, по гену APC частота гиперметилирования в нашей работе составила 40 % против 21-28 %, определенной методом MSP; по гену CDH13 – 58 % против 32–65 % соответственно [12, 15].

Мы оценили корреляцию возрастных, гендерных и клинических показателей (табл.1) с уровнем CpG-метилирования исследованных промоторных участков. Ранее было показано отсутствие ассоциаций между возрастными, гендерными, гистологическими показателями и статусом CpG-метилирования гена APC в неопластических образованиях толстой кишки [5]. По данным других исследователей, с возрастом происходит увеличение уровня метилирования

таблица 2 Последовательность праймеров (5’-3’) для пиросеквенирования [14] Ген Прямой праймер Обратный праймер Секвенирующий праймер APC biotin – ttt ttt tgt ttg ttg ggg att act aca cca ata caa cca cat atc Py1: aca caa cta ctt ctc tct cc APC -/- -/- Py2: ccc aca ccc aac caa CDH13 ttg gga agt tgg ttg gtt g biotin – aca acc cct ctt ccc tac ct gga aaa tat gtt tag tgt ag MGMT (Fw) gga tat gtt ggg ata gtt biotin-aca aca cct aaa aaa cac tta aaa c gat ttg gtg agt gtt tgg gt MGMT (Re) biotin- gga tat gtt ggg ata gtt aca ac acct aaa aaa cac tta aaa c acc acc aca ctc acc aaa tc таблица 3

Метилирование промоторных участков генов APC, MGMT и CDH13 в условно нормальной и опухолевой тканях

Ген	Группа	Количество	Медиана Меt, %	Интерквартильный интервал Меt, %	Достоверность различий Меt по сравнению с условно нормальной тканью в U-тесте, p
	N	25	6,0 %	4,3–7,5 %
APC	CRC-Меt_H	10 (40 %)	31,8 %	11,6–34,5 %	<0,001*
	CRC-Меt_L	15 (60 %)	4,5 %	3,0–8,0 %	0,212
	CRC	25	9,0 %	3,5–14,0 %	0,195
	N	24	10,0 %	8,0–11,8 %
CDH13	CRC-Меt_H	14 (58 %)	25,8 %	20,8–31,4 %	<0,001*
	CRC-Меt_L	10 (42 %)	9,5 %	8,0–14,4 %	0,814
	CRC	24	16,5 %	12,0–26,4 %	<0,001*
	N	25	3,0 %	2,0–4,0 %
MGMT	CRC-Меt_H	10 (40 %)	10,5 %	9,3–16,3 %	<0,001*
	CRC-Меt_L	15 (60 %)	2,8 %	2,0–4,0 %	0,924
	CRC	25	4,0 %	2,1–10,0 %	0,016*