Адаптационно-компенсаторные реакции на ранней стадии острой интоксикации крыс дельтаметрином

Мировой рынок синтетических пиретроидов оценивается более чем в 2,5 млрд долларов. В ближайшие годы он будет расти и к 2019 году превысит 3 млрд долларов (1). Препараты этой группы обладают высокой биологической активностью, позволяющей вести эффективную борьбу с насекомыми на разных стадиях их развития. Для теплокровных животных более токсичны вещества, содержащие циангруппу (2, 3).

Дельтаметрин — (S)- α -циано-3-феноксибензил(1R,3R)-3-(2,2-дибром-винил)-2,2-диметилциклопропанкарбоксилат — в течение многих лет с успехом используется в растениеводстве и животноводстве. Этот моноизомер синтетических пиретроидов с выраженной токсичностью представляет 516

реальную угрозу отравления при нарушении регламентов применения. Несмотря на многочисленные исследования по токсикологии пиретроидов (4-6), вопросы патогенеза острого отравления препаратами этой группы, принципы лабораторной диагностики на ранней стадии интоксикации и патогенетической терапии при отравлении требуют глубокого экспериментального обоснования.

Развитие патологического процесса при экзогенных интоксикациях сопровождается изменением взаимосвязей адаптационно-компенсаторных механизмов. Тяжесть течения и исход отравления во многом определяются выраженностью функциональных нарушений эндокринной и иммунной систем (7, 8). Их своевременное выявление способствует совершенствованию качества диагностики, а также профилактике осложнений.

В настоящей работе мы выполнили биохимическую и гистологическую оценку влияния острой экспериментальной интоксикации дельта-метрином на эндокринную и иммунную систему крыс. Эти данные вносят вклад в понимание приспособительных механизмов и функциональных резервов организма у млекопитающих при пестицидном токсикозе, что необходимо для разработки способов его диагностики и фармакокоррекции.

Нашей целью было изучение динамики адаптационно-компенсаторных реакций на ранней стадии острой интоксикации дельтаметрином.

Методика . Эксперименты проводили на белых лабораторных крысах линии Wistar, которые считаются эталонными объектами в многочисленных биомедицинских исследованиях на млекопитающих (9). Из самцов крыс (масса 180-200 г) сформировали 6 групп. Животным II ( n = 12), IV ( n = 12) и VI ( n = 12) групп через зонд в желудок вводили дельтаметрин в дозе 43,5 мг/кг массы тела (¹/₂ ЛД₅₀). Крысы I ( n = 10), III ( n = 10) и V ( n = 10) групп (контроль) получали эквивалентный объем физиологического раствора. Крыс разных групп выводили из эксперимента последовательно: I и II — через 1 сут, III и IV — через 3 сут, V и VI — через 1 нед после начала опытов. В эти же сроки у животных брали кровь для исследования.

Применяли препаративную форму дельтаметрина Butox 50 («Intervet», Нидерланды). При проведении опытов соблюдались требования Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 года) (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimentation and other Scientific Purposes, ¹ 123 of 18 March 1986, Strasbourg).

В цельной крови крыс оценивали содержание глюкозы при помощи унифицированного глюкозооксидазного метода, в сыворотке — концентрацию инсулина и кортикостерона. Количество инсулина определяли посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ-ИФА) «сэндвич»-методом, содержание кортикостерона — прямым конкурентным методом ИФА с иммобилизованными на твердую фазу антителами. Для иммуноферментного анализа использовали готовые наборы реагентов фирмы «Cusabio Biotech Co., Ltd» (Китай).

Кусочки тимуса животных, полученные после убоя, фиксировали в 4 % нейтральном растворе формальдегида, обезвоживали в спиртах с возрастающей концентрацией и уплотняли, заливая в парафин. Гистологические срезы толщиной 3-5 мкм получали на ротационном микротоме (CUT 4055, «SLEE Medical GmbH», Германия) и окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Ван-Гизону. Для выявления тучных клеток срезы окрашивали основным коричневым по Шубичу (10). Микрофотосъемку гистологических препаратов проводили на цифровом микроскопе Альтами БИО 1 («Альтами», Россия).

Данные обрабатывали в программе Statistica 6.0 («StatSoft, Inc.», США). Результаты представлены в виде медианы (Me) и интерквартильной широты (Q1-Q3). Межгрупповое сравнение выполняли при помощи непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты . После однократного введения дельтаметрина в дозе 43,5 мг/кг массы тела у животных в опытных группах отмечали возбуждение и гиперсаливацию. В 1-е сут эксперимента аппетит у них отсутствовал, резко сократилось количество потребляемой воды. В дальнейшем выраженность клинического проявления интоксикации снижалась.

Результаты биохимических исследований свидетельствовали о развитии гиперкортикостеронемии на ранней стадии интоксикации. Концентрация кортикостерона в сыворотке крови через 1 сут после введения крысам дельтаметрина была на 46,3 % выше, чем в контрольной группе (табл.). Постепенно содержание гормона снижалось, и через 3 сут различия с контролем составляли 30,9 %. Усиленная секреция кортикостерона в течение 3 сут после интоксикации могла быть связана с нейротоксическим действием препарата. Гипоталамус реагирует на химический стресс выбросом кортиколиберина, что способствует усиленному синтезу и секреции адренокортикотропного гормона передней долей гипофиза (11). При этом повышается содержание кортикостерона в надпочечниках за счет активации 3- β -гидроксистероиддегидрогеназы (12), что ведет к развитию гипер-кортикостеронемии и нарушению углеводного обмена.

Биохимические показатели крови у белых лабораторных крыс линии Wistar при острой интоксикации дельтаметрином

Срок	Группа	Кортикостерон, нмоль/л Y	Инсулин, нМЕ/мл	Глюкоза, ммоль/л
1-е сут	I (контроль)	417 (378-500)	457 (394-565)	6,73 (6,02-7,62)
	II	610 (577-711)	603 (486-700)	8,45 (7,57-10,8)
		p [k1] = 0,0001	p [k1] = 0,0139	p [k1] = 0,0052
3-и сут	III (контроль)	395 (366-470)	484 (390-563)	6,35 (5,94-7,81)
		p [k1] = 0,6683	p [k1] = 0,8429	p [k1] = 0,8695
	IV	517 (455-621)	329 (257-412)	8,56 (7,22-10,3)
		p [k3] = 0,0130	p [k3] = 0,0048	p [k3] =0,0412
		p [d1] = 0,0612	p [d1] = 0,0001	p [d1] =0,6031
7-е сут	V (контроль)	428 (368-502)	471 (375-571)	6,40 (5,96-7,81)
		p [k1] = 0,9741	p [k1] = 0,9604	p [k1] =0,9548
		p [k3] = 0,7053	p [k3] = 0,6792	p [k3] =0,8201
	VI	354 (288-410)	389 (294-468)	5,13 (4,29-6,30)
		p [k7] = 0,0407	p [k7] = 0,1209	p [k7] = 0,0267
		p [d1] = 0,0002	p [d1] = 0,0001	p [d1] = 0,0001
		p [d3] = 0,0001	p [d3] = 0,1574	p [d3] = 0,0001

П р и м еч а ни е. Описание групп см. в разделе «Методика». Приведены значения Me(Q ₁ -Q ₃ ), где Me — медиана, Q ₁ -Q ₃ — интерквартильная широта; p [_k1] — уровень значимости различий в сравнении с контролем через 24 ч, p [_k3] — в сравнении с контролем через 3 сут, p [_k7] — в сравнении с контролем через 7 сут, p [_d1] — в сравнении с крысами из II опытной группы, p [_d3] — в сравнении с крысами IV опытной группы.

Концентрация глюкозы в крови у крыс через 1 сут после введения дельтаметрина оказалась на 25,6 % выше аналогичного показателя в контроле. Содержание инсулина возросло на 31,9 %, что свидетельствовало о временной инсулинорезистентности, причиной которой могла быть высокая доступность липидов для окисления.

Глюкоза занимает далеко не главное место среди используемых для окисления митохондриями субстратов, в отличие от кетоновых тел, коротко- и длинноцепочечных жирных кислот (13). Гипергликемия сохранялась и спустя 3 сут после интоксикации (см табл.) за счет стимуляции глюкокортикоидами глюконеогенеза, а также расщепления запасов гликогена в печени и снижения интенсивности гликолиза (14). Однако содержание инсулина снижалось на 32,0 % по сравнению с аналогичным показателем в контроле. Причиной снижения концентрации инсулина в крови 518

на фоне стойкой гипергликемии могло быть нарушение функции β -клеток островков Лангерганса в поджелудочной железе. Дисфункция β -клеток, вероятно, стала результатом действия нескольких факторов. Первый из них — гиперлипидемия, вызванная повышением количества кортикостерона в крови у крыс после введения дельтаметрина. Высокое содержание жирных кислот в крови способствует их аккумулированию β -клетками, что ведет к усилению свободно-радикальных процессов, главным образом через активацию NO-синтазы, приводящих к гибели клеток по типу апоптоза (15). Второй фактор — гипергликемия. Механизмы ее неблагоприятных последствий хорошо изучены. Это избыточная продукция свободных радикалов, процессы гликирования и изменения в работе регуляторных белков (16). Кроме того, гипергликемия может снижать секреторную функцию β -клеток (17).

Через 1 нед после 1-кратного введения дельтаметрина у крыс развивалась гипокортикостеронемия (см. табл.). Это указывало на снижение секреции кортиколиберина и адренокортикотропного гормона центральными эндокринными железами, а также могло быть связано с дефицитом восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфата и аскорбата, регистрируемым при активации свободно-радикальных процессов и перекисного окисления липидов в надпочечниках.

Важное значение имеет снижение активности 3- β -гидроксистеро-иддегидрогеназы в коре надпочечников (18). Этот фермент чувствителен к активации свободно-радикальных процессов и увеличению концентрации продуктов перекисного окисления липидов (19). Ранее нами и другими исследователями отмечалось развитие окислительного стресса у крыс при острой интоксикации дельтаметрином (20-24).

С развитием гипокортикостеронемии у крыс наблюдалось снижение содержания глюкозы в крови на 19,8 % относительно контроля, что было связано с замедлением реакций глюконеогенеза на фоне активации гликолиза с возможным истощением запасов гликогена в печени (25). Тран-зиторный характер гипергликемии способствовал нормализации секреции инсулина (см. табл.).

Взаимосвязь иммунной и эндокринной систем обусловливает не только непосредственное участие иммунной системы в стресс-реакциях, но и определяет влияние стресса на иммунную реактивность организма. В связи с этим мы провели гистологическое исследование центрального органа иммунной системы — тимуса у контрольных и опытных крыс.

Гистоструктура тимуса у контрольных крыс оказалась представлена отдельными дольками, разделенными септами из соединительной ткани, капсула образована неоформленной волокнистой соединительной тканью. В структуре каждой дольки были четко дифференцированы зоны коркового и мозгового веществ, граница между ними хорошо различима. В корковом веществе были отчетливо видны отдельные тимоциты, лимфобласты, эпителиальные клетки; в мозговом веществе плотность расположения клеточных элементов оказалась меньше, сосудистая сеть тимуса была умеренно наполнена кровью.

Увеличение секреции гормонов гипоталамо-гипофизарно-кортикоад-реналовой системы при остром отравлении животных снижало содержание лимфоидных клеток в тимусе. На гистологических препаратах тимуса крыс через 3 сут после введения дельтаметрина наблюдалось заметное обеднение долек органа тимоцитами (рис., А) с инверсией коркового и мозгового веществ, что затрудняло визуальное определение границы между ними. Это было характерно для всех долек тимуса и регистрировалось у всех жи- вотных из опытных групп в течение 3 сут после интоксикации, различия заключались лишь в степени выраженности указанных изменений. Уменьшение числа тимоцитов сопровождалось интенсификацией апоптоза в органе с фрагментацией ядер клеток и образованием апоптотических телец. На развитие гемодинамических расстройств указывало скопление форменных элементов крови в просвете сосудов. Интоксикация животных дель-таметрином сопровождалась увеличением количества тучных клеток, расположенных преимущественно в междольковой соединительной ткани, вблизи кровеносных сосудов и значительно реже в паренхиме органа. У животных из опытных групп наблюдали интенсификацию процессов дегрануляции тучных клеток.

Отмеченные патоморфологические изменения в тимусе животных, подвергнутых действию дельтаметрина, свидетельствуют о снижении их иммунной реактивности в условиях гиперкортикостеронемии. Известно, что глюкокортикоиды обладают выраженным иммунодепрессивным действием, нарушают кооперацию клеток иммунной системы и индуцируют апоптоз тимоцитов (26, 27).

А

Гистологическая структура тимуса у белых лабораторных крыс линии Wistar после введения дель-таметрина в дозе 43,5 мг/кг: А — на 3-и сут, наблюдается уменьшение плотности тимоцитов в мозговом веществе (увеличение ½600), Б — на 7-е сут, клеточ-ность тимуса частично восстановлена (увеличение ½300) (микроскоп Альтами БИО 1, «Альтами», Россия; окрашивание гематоксилином и эозином).

Снижение содержания кортикостерона через 1 нед после интоксикации сопровождалось частичным восстановлением клеточности тимуса у крыс (см. рис., Б). В течение эксперимента не отмечали гибели животных, что свидетельствовало об эффективности адаптационно-компенсаторных механизмов, в том числе ги-поталамо-гипофизарно-тимусной системы (28), участвующей в торможении гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, которая доминирует при всех видах стресса.

Характер эндокринных и иммунных нарушений на ранней стадии острой интоксикации дельтаметрином указывал на высокую степень риска иммунодефицитных состояний в отдаленный постинтоксикационный период, что подтверждают многочисленные примеры органной патологии при воздействии пестицидов (29).

Таким образом, острая интоксикация крыс дельтаметрином сопровождается развитием гиперкортикостеронемии и гипергликемии на фоне инсулинорезистентности. В течение 3 сут содержание инсулина в сыво- ротке крови резко снижается и по мере уменьшения концентрации глюко- зы и кортикостерона постепенно нормализуется, достигая контрольных значений через 1 нед после интоксикации. Об угнетении иммунной реактивности животных свидетельствует уменьшение числа лимфоидных клеток в тимусе и активизация процессов апоптоза. Возрастающая частота появления тучных клеток и процессы дегрануляции указывают на аллергизи-520

рующее действие препарата. Результаты наших исследований вносят вклад в понимание компенсаторно-приспособительных механизмов при экспериментальной интоксикации и позволяют оценить функциональные резервы организма для разработки способов фармакокоррекции при отравлениях.

Авторы благодарят сотрудников Омской областной ветеринарной лаборатории за содействие в проведении экспериментов.