Адаптивные признаки Azotobacter chlorococcum Beiyrinck и Bacillus mycoides Flugge в городских почвах

Живые организмы почв - это природный универсальный фактор почвообразования и динамики почв [Добровольский, Никитин, 2006], Мир микробов является непременной частью педобиоты. Специфической средой обитания микроорганизмов являются почвы и почвоподобные образования городских территорий [Скворцова, 1997; Марфенина, 2005; Почвы в биосфере..,, 2012]. Городские почвы испытывают хроническое воздействие урбаногенных факторов, что не может нс сказаться на биологической активности и биоразнообразии почвенных образований, на их плодородии и самоочищении. Почвообразовательная деятельность микроорганизмов в городских условиях обитания вызывает особый интерес. Однако экологофизиологические возможности выживания микробного населения изучены недостаточно.

В бактериальном сообществе урбаноземов г. Перми превалируют неспорообразующие бактерии, на долю бацилл приходится около 6%. По сравнению

(С Артамонова В. С., ЕремченкоО. 3,2015

с зональными дерново-подзолистыми почвами обнаружено более слабое развитие микроскопических грибов. увеличение числа колониеобразующих единиц (КОЕ) актиномицетов* Наиболее характерной особенностью урбаноземов является их высокая заселенность азотобактером [Москвина, 2004; Коньшина, 2014]. Активизацию роста азотобактера, как и других щелочелюбивых или щелочеустойчивых бактерий в почвах селитебных территорий связывают с подщелачиванием почв [Куличева и др„ 1996; Скворцова. 1997; Артамонова, 2002].

Развитие азотобактера в почвах во многом зависит от присутствия связанных форм азота, которые на первых этапах аммонификации убывают из-за роста бактерии Bacillus mycoides, предпочитающей аммонийные формы в отличие от других бацилл. Аэробная спорообразующая бактерия Вос. mycoides хорошо представлена в почвах, где минерал изационные процессы протекают слабо [Мишустин, 1966. 1972], и урбаноземы г. Перми Б этом отношении не исключение. Следует сказать, что наряду с бактериальной иммобилизацией аммонийного азота происходит его трансформация нитрифицирующими микроорганизмами до азотной кислоты и газообразного аммиака, который существенно теряется при подщелачивании почв. Возмещение потерь азота в почвенной среде путем фиксации молекулярного азота из атмосферы самим азотобактером, скорее всего, невелико, поскольку процесс энергозависим, а источники энергии в урбаноземах ограничены. Не исключено, что при этом активность нитрогеназы может быть ингибирована тяжелыми металлами [Тейт, 1991] -постоянными загрязнителями городских почв [Ильин, Сысо: 2001; Якубов, 2005; Минкина. Моту зова, Назаренко, 2009; Ильин, 2012]. В свою очередь, разложение азотсодержащих экзометабо-литов азотобактера также снижено, особенно в присутствии меди и железа - до 50% [Тейт, 1991]. Не случайно в городских почвах азотобактер обнаруживает специфические особенности роста и развития: в присутствии тяжелых металлов в городских почвах изменяется скорость роста азотобактера, диаметр его колоний, частота обрастания почвенных комочков, расширяется разнообразие культурально-морфологических вариантов [Скворцова. 1997; Артамонова, 2002_? 2014; Семенова. Суюндуков. 2013].

Существование микроорганизмов в условиях различной почвенной среды вызывает специфические изменения приспособительного характера [Мишустин. 1975]. Ранее сообщалось [Красильников. 1958]. что в неблагоприятных условиях у бактерий проявляются атипичные формы колоний, что диагностируется по спектру полиформных КОЛОНИЙ Az. chroococcum, так и Вас. mycoides, расту щих на агаризованных средах. Типичная форма Вас. mycoides дает мицелиальные плоские колонии, стелющиеся по поверхности агара с образованием пучков нитей, отходящих от края колонии и образующих ложное ветвление [Разумовская, Чижик, Громов, 1960]. Нити могут быть закручены направо или налево. Атипичные формы обнаруживают признаки роста, свойственные другим видам данного рода [Красильников, 1958]. Диссоциирование бактерий с образованием разных типов колоний рассматривается как признак адаптации к новым условиям среды [Скворцова. 1997].

Сравнительно устойчивы к техногенному загрязнению микроскопические грибы [Тейт. 1991; Евдокимова. 1995], в том числе опасные для растений [Артамонова и др., 2007; Артамонова. Лютых. Смирнова. 2009]. Учитывая, что тяжелые металлы негативно отражаются на росте растений [Титов и др., 2007; Ильин. 2012], грибы, участвующие в повышении подвижности экотоксикан-тов (например, меди, никеля, цинка) [Марфенина, 2005]. могут оказаться причиной их активного метаболического поглощения растением, интенсивной диффузии в свободное пространство корня, а затем - угнетения всего растения. В этой связи, особый интерес вызывают штаммы азотобактера, которые проявляют фунгистатичность и фунги-цидность к фитопатогенам (грибам родов I erticil-lium, Helminthosporium, Pytium, Fusarium ит.д). В зависимости от условий обитания отдельные культуры азотобактера различаются по своим антагонистическим свойствам. Они обязаны продуцированию азотобактером антибиотиков [Мишустин, Емцев. 1970; Мишустин. 1972; Придачина, 1984].

Крайняя пестрота почвенного покрова города, его прерывистость и мозаичность служат источником сохранения определенных родов и видов бактерий, поддержанию их пула даже в условиях локального токсического загрязнения и ухудшения водно-воздушных и физических свойств [Строганова, Мягкова, Прокопьева. 1997]. По этой причине следует ожидать широкий спектр адаптационных механизмов у микробиоты, которые позволяют ее представителям выжить и обеспечить функционирование почвы как биокосной системы.

Цель нашей работы заключалась в изучении особенностей роста (процент обрастания комочков почвенного мелкозема и скорость роста бактерии вокруг них) и антифунгального действия Azotobacter chroococcum, а также формы колоний Bacillus mycoides, выделенных из почв и почвоподобных образований района разноэтажной застройки г. Перми. Ранее подобные исследования почвенных бактерий на территории Западного Урала не проводились.

Материалы и методы исследования

Для изучения бактерий были отобраны 13 проб с глубины 0-20 см из урбаноземов и почвоподобных образований на территории селитебного района разноэтажной застройки г* Перми. В почвенных образцах определили водное и солевое pH -потенциометрическим методом, содержание органического углерода - по Тюрину, содержание подвижных фосфатов фотометрическим методом в вытяжке по Кирсанову', подвижный калий пламенно-фотометрическим методом в кислотной вытяжке по Кирсанову.

Метод обрастания почвенных комочков Az. chroococcum по Н А. Красильникову [1958], обеспечивает выявление бактерии даже при низкой встречаемости. Этот метод наиболее приближен к естественным условиям обитания [Сэги_? 1983: Алексеева, 2005]. Показатель количества азотобактера по числу обросших комочков (частота колонизации), упоминается в списке критериев оценки биологической активности почв [Методические указания,,., 2003], а процент подавления роста азотобактера включен в список эколого-гигиенических показателей определения класса опасности отходов производства и потребления [СП 2. L7.13 86-03 ].

В нашей работе комочки мелкозема раскладывались на агаризованной среде Эшби из расчета 50 штук на чашку Петри в 3^1 — кратной повторности [Бабьева, Агре, 1971J. Чашки инкубировали в термостате при 28°С. Учет площади каждого комочка мелкозема и площади ореола вокруг него производили посуточно [Сэги, 1983]. Основанием для расчета площади комочка мелкозема было визуальное увеличение их площади и в некоторых случаях -«распада», что связано с ростом и отмиранием клеток, разре шением физических сцеплений между частицами. Учет площади ореола и комочка осуществляли по фотографиям. анализируемым на мониторе компьютера в программе «Corel» с применением увеличения изображения в 400 раз

Для выявления антифунгального действия использовали метод «почвенного сэндвича» [Сэги* 1983], когда на газон микромицетов помешаются диски 2-суточной культуры азотобактера, а затем выявляются зоны угнетения грибов.

Полиформ ность колоний Вас. mycoides регистрировали на мясопептонном агаре (МПА).

С целью фитотестирования на почвенных пробах в течение 10 дней выращивали кресс-салат Lepidium sativum L* сорта «Дукат», у которого определены показатели высоты и массы (средняя сырая масса одного растения и общая сырая масса растений).

Результаты исследований обработаны с применением математической статистики и корреляционного анализа при помощи пакета программ Slalislica 6.0.

Результаты и их обсуждение

В исследованных урбаноземах и почвоподобных образованиях агрохимические свойства в слое 0-20 см заметно варьировали (табл. 1). Изменчивость количества органического углерода была высокой и колебалась от 0.81 до 3.77%. Ранее установлено, что содержание органического углерода в почвах г. Перми зависит от зональных особенностей почв, от состояния растительности и внесения торфокомпоста [Еремченко. Москвина. 2005], Реакция почвенного раствора колебалась от нейтральной до щелочной, что достаточно типично для почв районов многоэтажной 'застройки и связано с использованием при строительстве карбонатных материалов, применением антигололёдных средств [Еремченко, Москвина, 2005: Shestakov, Erenichenko, Firkin, 2013]. Обеспеченность подвижным фосфором и калием была высокой, что вполне соответствует общей закономерности накопления этих биогенных элементов в почвах других городов России [Строганова. Мягкова, Прокопьева, 1997: Башаркевич. Самаев, 2007J.

Таблица I

Данные статистической обработки свойств почв жилых районов г, Перми (слой 0-20 см)

Показатель	Среднее	Диапазон	Доверительный интервал		Коэффициент вариации, %
			-95%	+95%
С орг. %	1.9	0.8-3.8	1.5	2.35	39
pH вод	7.7	7.3-8.0	7.6	7.9	3
pH сол	5.8	5.6-6.2	5.7	5.9	3
Фосфор ПОДВИЖНЫЙ, Р2О5 мг/100 г	45.3	12.3-78.0	32.4	58.3	47
Калий подвижный, мг/100г	35.2	21.5-45.0	30.7	39.8	21

Кресс-салат рекомендуют для исследования токсичности почв в качестве тест-культуры, так как он отличается быстрым ростом и почти стопроцентным прорастанием, отражает токсичность почв [Дховский и др., 2003; Багдасарян. 2005].

Высота и масса растений при выращивании на пробах из почв жилого района г. Перми изменялась в широких пределах (рис. 1). Хуже всего растения чувствовали себя при выращивании на пробе №13, где средняя масса растений была в 2.5 раза ниже по сравнению с наиболее благоприятными вариантами*

Площадь ореола обрастания Az. chroococcum из разных почв отличалась более чем в 2 раза, площадь минимальной колонии составляла 58-65% от площади колонии наибольшего размера (табл. 2)* Низкими показателями роста отличились бактерии из почвенных проб № 4-6* Максимальные показатели роста имели бактерии из многолетнего урбанозема (проба ЮХ сформировавшегося в саду на территории гимназии (рис* 2).

о Ряд1

□ Ряд2

Пробы

Рис. L Показатели состояния кресс-салата: ряд 1 - высота (см), ряд 2 - масса растении (г)

В последние годы экофизиологические особенности бактерий рода Azotobacter используют для индикации химического загрязнения почвы [Мын-баева, Курманбаев, Воронова, 2011], в оценке экологического состояния почв* загрязненных нефтепродуктами и тяжелыми металлами [Феоктистова* 2012]* выявлении изменений биологических свойств почв при загрязнении тяжелыми металлами [Капралова, 2012]*

Рис. 2* Площадь колоний Az. chroococcum. мм²:

ряд 1 - прирост за 1-е сутки* ряд 2 - прирост за 2-е суток, мм'

Таблица 2

Показатели роста колоний Az- chroococcum из почв жилых районов г, Пермь* мм²

Показатель	Среднее	Диапазон	Доверительный интервал		Медиа-на
			-95%	+95%
Плошддь ореола за первые сутки	63.8	47.1- 102.0	53.9	73.7	56.4
Площадь ореола за двое суток	82.0	52.4-113.7	70.7	93.3	84.8
Площадь колонии за первые сутки	156.7	128.2- 198.6	141.3	172.1	140.5
Площадь колонии за двое суток	189.1	141.9-243.3	169.7	208.4	197.6

Нами была сделана попытка применить показатели роста азотобактера для оценки биологической активности почв жилого района г. Перми. С этой целью данные по свойствам почв, состоянию кресс-салата и росту колоний азотобактера подвергли математической обработке с применением непараметрического корреляционного анализа* В расчетах также использовано соотношение между7 площадью ореола и площадью комочка почвы* так как эта величина в наибольшей степени будет отражать прирост бактериальной колонии* Тесноту и достоверность связи между7 количественными рядами оценивали по коэффициенту7 Спирмена. Установлена определенная связь между соотношением площади ореола колонии Az. chroococcum к площади комочка почвы после 2-сут* роста и содержанием подвижного фосфора, калия* средней и общей массой кресс-салата (табл. 3). Можно утверждать, что чем больше питательных веществ в почве и лучше состояние растений, тем шире отношение между площадью ореола колонии и площадью комочка почвы. Рансе при фитотестировании городских почв было установлено, что состояние крссс-салата тесно связано с агрохимическими и биохимическими свойствами корнеобитаемого слоя [Еремченко, Москвина, Шестаков, 2014]. Очевидно, рост колоний азотобактера также следует включить в набор информативных показателей биологической активности почв жилых районов г. Перми.

Антагонистическое действие азотобактера проявилось в подавлении роста представителей родов Tnchoderma и Ми сиг. отмеченное в посевах из отдельных почвенных проб. Около дисков с кулыу-рой азотобактера на грибном газоне заметны зоны растворения мицелия* ширина ореолов лизиса достигает 3.6 мм. Данные микромицеты относятся к активным аммонификаторам белковых веществ* могут конкурировать за все формы связанного азота, в которых нуждается азотобактер* а также за углерод* как конструктивный и энергетический материал. Проявление азотобактером антифунгаль-ной способности - явление нс частое* но всегда вызывающее интерес у почвенных микробиологов.

В отдельных пробах азотобактер обнаружил слизеобразование и пигментообразование, что вновь демонстрирует разные стратегии его конкурентного выживания в городских почвах с сильно варьирующими свойствами* загрязненны*х различными веществами*

Таблица 3

Коэффициент корреляции между показателями роста колоний азотобактера, с одной стороны, свойствами почв и состоянием кресс-салата, с другой

Показатель	S ореола за 1 сут., мм2	S колонии за 1 сут., ММ"	S ореола/S комочка за 1 сут.	S ореола за 2 сут., мм2	S колонии за 2 сут., Ъ ' ММ'	S ореола/ S комочка за 2 сут.
Сорт	-0.31	-0.34	-0.28	0.13	0.15	0.05
pH вод	-0.03	0.02	0.08	-0.44	-0.41	-0.51
pH сол	0.08	0.06	0.23	-0.27	-0.27	-0.25
Р, мг/100 г	-0.45	-0.54	-0.01	0.10	0	0.58*
К, мг/100 г	0.02	-0.02	0.48	0.43	0.30	0.69
Высота растений, мм	-0.03	-0.18	0.03	0.34	0.27	0.48
Масса растений средняя, г	0.02	-0.07	0.39	0.41	0.33	0.82
Масса растений общая, г	-0.14	-0.23	0.27	0.42	0.31	0.67

* Жирным шрифтом выделены значимые коэффициенты; S - площадь.

В

Рис. 3. Полиморфизм Bacillus mycoides (рост на среде МПА. 18 часов):

А - мицелиальная форма колоний, Б - пастообразные блестящие колонии с утолщенными ризоидными образованиями и продуцированием розового пигмента, В - колонии без выраженного мицелиального роста и без пигментообразования

Bacillus mycoides из разных почвенных проб формировал типичные (мицелиальные) и атипичные колонии (рис. 3). В пробах, где азотобактер обнаруживал сли'зеобразование и пигментообразо-вание, доля типичных колоний резко снижалась и преобладающими оказывались пастообразные блестящие колонии с утолщенными ризоидным и образованиями и колонии без выраженного мицелиального роста. Такая изменчивость Вас. mycoides может быть приспособлением бактерии к экотоксиканту, который подавляет распад органических соединений, а значит и ограничивает приток легкодоступного азота.

Заключение

Таким образом, изученные представители микробиоты почв и почвоподобных образований жилых районов г. Перми показали разнообразные адаптивные признаки выживания. Az. chroococcum становится типичным представителем городских почв. Своеобразные по физико-химическим свойствам субстраты, обязанные человеку с его многообразным воздействием на окружающую среду, обеспечивают условия для выживания азотобактера после иммиграции из плодородных почв. Этому благоприятствует отсутствие кислотности и запас питательных элементов. Показатель скорости обрастания колониями почвенных комочков прямо пропорционально связан с обеспеченностью подвижными формами фосфора и калия, состоянием тест-культуры. Приспособительные возможности азотобактера к новой среде демонстрирует синтез экзометаболитов, обладающих антибиотическими свойствами.

У Вас. mycoides наряду с типичным микоид-ным строением колоний обнаружены новые культурально-морфологические варианты, характерные для тех же проб, где азотобактер реализовал способность к слизе- и пигментообразованию.

Возможно, оба исследуемых вида проявили приспособительную изменчивость к определенной техногенной нагрузке. Состояние микробиоты в обстановке возрастающего антропогенного пресса требует дальнейшего углубленного изучения. Исследования механизмов биогенности и «антропофи льности» преобразованных и нарушенных почв урбанизированных территорий Пермского края продолжаются.