Агробактериальная трансформация культуры клеток василистника малого (Thalictrum minus L.)

Разработан метод агробактериальной трансформации каллусной культуры клеток лекарственного растения - василистник малый. Для трансформации использовали штамм Agrobacterium tumefaciens, содержащей коинтегративный вектор pGV 3850. Плазмида содержит целевой ген ipt, кодирующий ключевой фермент биосинтеза цитокининов - изопентенилтрансферазу, под промотором 35S вируса мозайки цветной капусты и селективный ген nptII, кодирующий фермент неомицинфосфотрансферазу, придающий устойчивость к канамицину, под контролем NOS промотора. Трансформировали два штамма «В» и 233, различающихся по интенсивности роста и уровню биосинтеза протобербериновых алкалоидов. Оценивали эффективность влияния на трансформацию вакуумной инфильтрации и экстракта табака. Отбор трансформированных каллусов проводили на сублетальной концентрации канамицина: для штамма «В» - 50 мг/л и штамма 233 - 20 мг/л. Устойчивые к канамицину клеточные линии оценивали методом ПЦР на наличие в них гена ipt. Отмечена отдаленная реакция на канамицин, то есть снижение жизнеспособности каллусов при отсутствии канамицина происходило к третьему пассажу. Наиболее низкая выживаемость каллусов отмечена в варианте с экстрактом табака. Однако методом ПЦР показано, что наиболее эффективным для трансформации был вариант с экстрактом табака без вакуумной инфильтрации. В результате были выделены ipt-положительные клеточные линии: пять клеточных линий из штамма 233 и одна клеточная линия из штамма «В». Эффективность трансформации (отбор на канамицине + ПЦР) для штамма 233 составила 14,6%, для штамма «В» - 0,1%. Из пяти ipt-положительных линий от штамма 233 две из них имели более высокую интенсивность роста и уровень содержания протобербериновых алкалоидов, единственная ipt-положительная линия от «В» штамма имела, наоборот, более низкую интенсивность роста и низкий уровень протобербериновых алкалоидов. Cреди ipt-положительных линий отмечена вариабельность по интенсивности роста и уровню биосинтеза протобербериновых алкалоидов.