Агробиологические признаки яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) при обработке семян химическим мутагеном фосфемидом

Основу продовольственной и биоресурсной безопасности составляют генетические ресурсы растений. К середине XXI века может быть утрачено до 60 % их видового состава (1, 2). Потери растительных ресурсов рассматриваются как один из факторов экологического кризиса биосферы (3), поэтому необходима стратегия сохранения и устойчивого ис- пользования биоразнообразия, предполагающая в том числе его расширение с помощью классических и современных методов.

Традиционный метод химического мутагенеза позволяет в относительно короткие сроки получить организмы с новыми признаками и свойствами (4). Он широко и эффективно применялся и применяется при создании селекционно ценных форм растений в различных почвенно-климатических условиях, в том числе в Западной Сибири (5-8). Развитие мутационной селекции может быть связано с применением известных химических супермутагенов (N-нитрозометилмочевина, N-нитрозоэтилмочевина, этиленимин), а также с открытием новых высокоактивных веществ (9). К ним относят хиральные стереоизомеры, используемые при производстве гербицидов, инсектицидов, фунгицидов (10). Мутагенным эффектом также обладают алкилирующие агенты, азотистая кислота, оксид азот, аналоги азотистых оснований и родственные им соединения, антибиотики, ин-теркалирующие агенты, топоизомеразы ядов (11).

В состав диэтиленимид-2-амидопиримидилфосфорной кислоты (фосфазин, syn. фосфемид — phospemidum) входят две группы этиленимина, соединенные с фосфором, и пиримидиновое основание. Этиленимин вызывает мутации, пиримидиновое основание включается в хромосому во время синтеза ДНК, определяя специфичность эффекта. Мутагенный эффект фосфемида (12) изучен нами ранее на модельном объекте Crepis capillaris L. (скерда волосовидная). На Triticum aestivum L. подобных исследований не проводили. Необходимый рабочий этап в экспериментальном мутагенезе — определение диапазонов концентраций, в которых возможно проявление нужных эффектов.

В настоящей работе впервые исследована специфичность мутагенного эффекта фосфемида на сортах (Cara и Скэнт 3) и гибридной форме яровой мягкой пшеницы и определено действие химического мутагена на изменчивость популяционных и индивидуальных признаков.

Нашей целью было изучение влияния фосфемида в разной концентрации на агробиологические признаки яровой мягкой пшеницы.

Методика. Исходный материал яровой мягкой пшеницы ( Triticum aestivum L.) был представлен пятью сортами из мировой коллекции Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР): отечественной селекции — Скэнт 1 и Скэнт 3 (var. lutescens, Россия, Тюменская обл.), иностранной селекции — Cara (var. erythrospermum , Мексика), Hybrid (var. ferrugineum , Мексика), Лютесценс 70 (var. lutescens , Казахстан). Предварительное изучение сортов проводили в 2006-2008 годах (Тюменский опорный пункт ВИР) (13). В 2009 году с использованием неполных диаллельных скрещиваний и принудительного опыления (14) были получены гибридные комбинации с участием названных сортов.

Сравнительную оценку гибридных и родительских форм в полевых условиях выполняли в 2010-2014 годах при посеве блоками с площадью питания каждого растения 10½20 см на первом этапе (F1) и при посеве семьями (потомство одного растения) — на последующих этапах (F2, F3 и др.). По каждой гибридной комбинации в F1 было проанализировано свыше 50, в F2 и последующих поколениях — 200 растений и более.

Эффективность химического мутагена фосфемида в концентрациях 0,002 и 0,01 % изучали на двух сортах (Cara и Скэнт 3) и гибридной форме F4 (Cara ½ Скэнт 3). Обработку проводили, помещая семена в растворы фосфемида на 3 ч; контролем служили семена, выдержанные в дистиллированной воде. Использовали по 300 семян каждого сорта и гибридной комбинации (по 100 в каждом варианте опыта — контроль,

0,002 % мутагена, 0,01 % мутагена) для лабораторных и по 300 семян для полевых исследований.

В лабораторных условиях определяли энергию прорастания семян и оценивали морфометрические параметры проростков (15). Индексы ингибирования роста рассчитывали как соотношение длины корней, побегов и числа корней проростков при действии мутагена и в контроле.

Поколение М1 в полевых условиях получали на экспериментальном участке биостанции «Озеро Кучак» (Нижнетавдинский р-н, Тюменская обл.) Тюменского государственного университета (ТюмГУ). Весной 2014 года высевали по 25 семян в 4-кратной повторности отдельно для каждого варианта обработки мутагеном. Индивидуально от каждого растения М1 получали потомство М2. Устойчивость образцов к листовым грибным болезням (мучнистая роса, листовая ржавчина и пятнистости) оценивали на естественном инфекционном фоне в течение всего вегетационного периода (с появления первых симптомов заболевания до усыхания листьев) (16). Патоген идентифицировали в лабораторных условиях с помощью микроскопической техники и влажной камеры (17). В М2 оценивали фенотипические изменения по морфологическим признакам колоса, стебля, листьев (окраска, опушение, форма, размеры) и по биологическим свойствам (позднеспелые, раннеспелые, растения озимого типа).

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием табличного процессора Microsoft Excel и программного обеспечения STATISTICA 6.0 («StatSoft Inc.», США). Для количественных признаков в таблицах представлены средние значения ( X _ср.) и ошибка среднего ( S_x ), для качественных — значение ( X ) и показатель изменчивости признака ( S ). Рассчитана достоверность различий между средними значениями вариантов с использованием t -критерия Стьюдента.

Результаты. Сорт Cara относился к группе низкорослых (высота растений 54,9 см), был устойчив к полеганию (7-9 баллов). Продолжительность его вегетационного периода составляла 77 сут, как и у сорта Hybrid, но была на 5-6 сут меньше, чум у сортов Скэнт 1, Скэнт 3 и Лю-тесценс 70. Сорт устойчив к поражению мучнистой росой и, по данным GRIS (Genetic Resources Information System for Wheat and Triticale), несет ген устойчивости к ржавчине Lr13 в устойчивом аллельном состоянии. Сорт Hybrid проявил высокие адаптивные свойства в крайне неблагоприятных метеорологических условиях 2008 года. В период прорастания семян и формирования всходов количество осадков составило 68,6 % от нормы, а среднесуточная температура воздуха была на 0,5 ° С выше средних многолетних значений, отмечался активный вылет шведской мухи. Сорт характеризовался высокой засухоустойчивостью (7 баллов) и средней устойчивостью к повреждению вредителем (5 баллов). Сорта Скэнт 1, Скэнт 3 и Лютесценс 70 включены в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию по 10-му Западно-Сибирскому региону России. Сорта среднеспелые (82-83 сут), с высокой полевой всхожестью семян и продуктивной кустистостью, а также умеренной восприимчивостью к болезням.

На основании результатов изучения 10 комбинаций внутривидовых скрещиваний (F1-F4) по показателям комбинационной способности, характеру взаимодействия генов, степени доминирования в первом поколении (F1), трансгрессии и наследуемости во втором поколении (F2) была отобрана гибридная форма Cara ½ Cкэнт 3. Ее высокие продуктивные свойства подтвердились при экологическом испытании гибридов F4 и F5 в трех географических пунктах: экспериментальный участок биостанции «Озе-572

ро Кучак» (ТюмГУ, Тюменская обл., Россия), Земля Баден-Вюртемберг (экспериментальный участок Вальдорфской школы, Германия), Земля Нижняя Саксония (опытная станция «Waldhof», Германия), существенно различающихся по природно-климатическим условиям.

Лучшая линия из гибридной комбинации Cara ½ Cкэнт 3 по биологической урожайности за 2013-2014 годы превосходила стандарты: в Тюменской области — сорта Новосибирская 15 и Иргина на 62,2 %, в Баден-Вюртемберге — Ashby и Scirocco на 44,1 %; в Нижней Саксонии преимущества относительно сортов Eminent и Granus не проявились (18). Гибрид характеризовался высокой устойчивостью к пятнистостям (возбудители Alternaria spp. и Helminthosporium spp.) и бурой ржавчине [ P. recondita Rob. ex. Desm f. sp. tritici Eriks. (= P. triticina Eriks.)].

Для расширения биоразнообразия исходного материала T. aestivum L. рассматривали возможность использования рекомбинационной и мутационной изменчивости. Одним из основных критериев успешного применения мутагена фосфемида служила доля измененных растений. В целом было проанализировано 1238 семей М₂ по двум сортам Cara и Скэнт 3 и 636 семей гибрида Cara ½ Скэнт 3 (табл. 1).

1. Эффективность применения мутагена фосфемида в разных концентрациях на яровой мягкой пшенице ( Triticum aestivum L.), оцененная в поколении М₂ ( Х _ср.± S_x , биостаниция ТюмГУ «Озеро Кучак», Нижнетавдинский р-н, Тюменская обл., 2014 год; полевой опыт)

Концентрация фосфемида, %	Сорта Cara и Скэнт 3, семей			Гибрид, семей
	всего, шт.		доля измененных, %	всего, шт.		доля измененных, %
	проанализировано	с изменениями		проанализировано	с изменениями
Контроль	329	12	3,6±1,03	120	9	7,5±2,40
0,002	550	72	13,1±1,44	272	27	9,9±3,28
0,01	359	64	17,8±4,08	244	74	30,3±2,95

Генотипические особенности сортов и гибрида по относительному выходу селекционно ценных форм можно было установить на основании их реакции на разные дозы мутагена. В наших опытах наибольшее число измененных растений как у сортов, так и у гибрида было обнаружено при концентрации мутагена 0,01 %.

Гибрид существенно отличался от селекционных сортов по спонтанной мутационной изменчивости. При изучении популяций сортов было обнаружено 3,6 % изменений, тогда как среди гибридных семей — в 2 раза больше (7,2 %).

Фенотипические изменения в вариантах с применением химического мутагена оказались достаточно разнообразными. В М2 были выделены следующие селекционно значимые типы: высокорослые, низкорослые, карлики, крупноколосые, растения озимого типа, позднеспелые, раннеспелые, с широким флаговым листом, с измененной формой и окраской колоса (спельтоидный, пирамидальный, желтый), с прочной соломиной. У гибридной формы наблюдалось 8 типов изменений из 12 обнаруженных. Наибольшую частоту появления измененных форм при воздействии раствора фосфемида в концентрации 0,01 % выявили у гибрида (30,33 %), при 0,002 % — у сорта Сara (15,31 %). Чаще регистрировали растения с крупным колосом, ранними или поздними сроками созревания, высокорослые, значительно реже — с измененной формой колоса. У гибрида преимущественно встречались крупноколосые формы (длина колоса 16,521,8 см) — 20,0 %; высокорослые (89,3-103,5 см) — 18,2 %; с прочной соломиной (устойчивость к полеганию 9 баллов) — 13,6 %; низкорослые и кар лики (39,8-61,2 см) — 16,4 %. Раннеспелые формы (созревание на 3-5 сут раньше, чем в контроле) в большем количестве появлялись у сортов Cara и Скэнт 3 — соответственно 24,2 и 12,3 %. Спельтоидный колос обнаружили на 5 растениях М2, выращенных из семян, обработанных фосфе-мидом в концентрации 0,01 % и проверенных в М3. Несмотря на то, что эти мутации доминантные и полудоминантные, в М1 мы их не выявили. Зерно в колосьях спельтоидного типа характеризуется повышенным содержанием белка (19), подробно изучена цитогенетика спельтоидов у мутантов (20). Наблюдаемые различия по частоте и разнообразию измененных форм у гибрида и исходных сортов могут быть связаны с их чувствительностью к мутагену.

2. Морфометрические показатели у проростков яровой мягкой пшеницы ( Triti-cum aestivum L.) в поколении М₁ при обработке семян фосфемидом в разных концентрациях (лабораторный опыт)

Концентрация фосфемида, %	Образец	Число зародышевых корней		Длина побега		Длина корней
		Х ср. ± S x , шт.	1 ИЧК	Х ср. ± S x , мм	1 ИДП	Х ср. ± S x , мм	] ИДК
Контроль	Сara	2,84±0,12	1,00	8,21±0,78	1,00	21,42±1,09	1,00
	Cara ½ Cкэнт 3	3,82±0,32	1,00	11,35±0,80	1,00	20,09±1,40	1,00
	Скэнт 3	3,82±0,21	1,00	9,18±0,85	1,00	13,19±0,99	1,00
0,002	Сara	2,80±0,12	0,99	3,22±0,13**	0,39	12,95±0,87**	0,60
	Cara ½ Cкэнт 3	3,56±0,22	0,93	11,17±1,34	0,98	15,07±1,41*	0,75
	Скэнт 3	3,64±0,27	0,95	8,56±1,00	0,93	12,57±1,24	0,95
0,01	Сara	2,81±0,14	0,99	4,83±0,21**	0,59	8,75±0,63**	0,41
	Cara ½ Cкэнт 3	3,25±0,31	0,85	6,44±1,42	0,57	11,69±1,81**	0,58
	Скэнт 3	1,80±0,37**	0,47	4,80±0,77**	0,52	8,44±2,56*	0,64
Прим еч ани е. ИЧК — индекс		числа корней, ИДП —		индекс длины	побега;	ИДК — индекс	длины
корней.
* и ** Различия с контролем статистически значимы соответственно при P < 0,05 и P < 0,01.

В лабораторном опыте для дифференциации сортов и гибрида по реакции на воздействие мутагена были исследованы средние значения признака и индексы ингибирования роста корней и побегов у проростков. Описание индексов как критерия реакции растений на стрессоры (низкие температуры, ионы алюминия, фториды, нитраты свинца, нефтяное загрязнение и др.) приводится в работах ряда авторов (21-23). В нашем опыте проростки яровой пшеницы проявили толерантность к действию фос-фемида по числу зародышевых корней (табл. 2). Достоверные отличия от контроля по этому признаку были обнаружены только у сорта Скэнт 3 (0,01 %). Значение индекса числа корней в этом варианте составило 0,47, в других вариантах с мутагеном — 0,85-0,99.

Самый сильный токсический эффект в отношении первичной корневой системы проявился у фосфемида в концентрации 0,01 %, при этом максимальной чувствительностью к мутагену характеризовался сорт Сara (ИДК = 0,41). У этого же сорта при низкой концентрации мутагена (0,002 %) отмечали уменьшение длины побега на 61,0 %, при 0,01 % — на 41,0 %. У сорта Скэнт 3 и гибрида Cara ½ Скэнт 3 более высокий токсический эффект наблюдался при концентрации мутагена 0,01 %. Стимулирования роста корней и побегов при воздействии фосфемида не обнаружили. Наибольшее угнетение ростовых процессов у исходных сортов и гибрида отмечали при концентрации мутагена 0,01 %.

Критериями оценки посевных качеств семян служили энергия прорастания в лабораторном эксперименте и полевая всхожесть. Мутаген в концентрации 0,002 % оказал стимулирующее влияние на скорость прорастания семян у гибридной формы, что способствовало увеличению энергии прорастания Cara на 5,9 % по сравнению с таковой у лучшего родительского сорта (табл. 3).

3. Чувствительность (относительно контроля, %) к обработке семян разными концентрациями фосфемида у родительских сортов и гибридной (F₄) формы яровой мягкой пшеницы в поколении М₁ ( Triticum aestivum L.) (биостанция ТюмГУ «Озеро Кучак», Нижнетавдинский р-н, Тюменская обл., 2013 год; лабораторный и полевой опыты)

Концентрация фосфемида, %	Образец	Энергия прорастания семян	Полевая всхожесть семян	Биологическая устойчивость
0,01	Сara	75,0*	37,0*	27,0*
	Cara ½ Cкэнт 3	47,1*	90,0	180,0*
	Скэнт 3	52,9*	64,9*	54,6*
0,002	Сara	100,0	97,0	90,0*
	Cara ½ Cкэнт 3	105,9*	67,0*	114,0*
	Скэнт 3	94,1*	82,4*	82,5*
* Различия с контролем (семена, выдержанные в дистиллированной воде) статистически значимы при P < 0,05.

В полевых условиях контрольные семена сортов и гибрида характеризовались высокой всхожестью (97-100 %). Во всех вариантах с фосфе-мидом отмечали снижение этого показателя, что может быть связано с нарушением ростовых процессов в зародыше. Сорт Cara показал высокую чувствительность к мутагену при концентрации 0,01 %. Биологическая устойчивость растений в этом варианте, рассчитанная как отношение числа растений, сохранившихся к уборке, к числу высеянных семян, была очень низкой (27,0 %). У гибридной формы, в отличие от исходных сортов, токсическое воздействие высокой концентрации по показателю полевой всхожести семян проявилось менее значительно, а по биологической устойчивости наблюдался эффект стимуляции. Повышенная резистентность гибрида F4 к химическому мутагену могла быть обусловлена гетерозиготностью, связанной с гибридным происхождением или индуцированной фосфемидом.

Выраженность количественных признаков, по мнению ряда авторов (24-27), зависит от продолжительности вегетационного периода, высоты растений, устойчивости к полеганию и чувствительности фотосинтетического аппарата к неблагоприятным факторам окружающей среды. Результатом сложного взаимодействия генотипа с условиями среды становится урожайность (28-30).

Выявлена неоднозначная реакция растений на воздействие мутагена по семенной продуктивности в М1. У гибрида Cara ½ Скэнт 3 при обработке семян фосфемидом в концентрации 0,01 % стимулирующий эффект проявился в статистически достоверном увеличении массы зерна с 1 м2 на 16,0 % по сравнению с контролем, у сортов Cara и Скэнт 3 отмечалось существенное снижение семенной продуктивности — соответственно на 67,0 % и 57,0 %. Гибрид, характеризующийся большей устойчивостью к химическому мутагену по выживаемости растений, имел и более высокие показатели по массе зерна в сравнении с исходными формами.

Родительские и гибридная формы существенно различались по распространенности (Р) грибных болезней на естественном инфекционном фоне. В 2013 году у растений пшеницы не было обнаружено поражений листьев возбудителями мучнистой росы Erysiphe graminis DC. и бурой ржавчины Puccinia recondita Rob. ex Desm. f . sp . tritici Eriks. (= P. triticina Eriks.). Распространенность поражения мучнистой росой достигла максимума (100 %) в 2014 году.

Наибольшую активность пятнистостей (возбудители Alternaria spp. и Helminthosporium spp.) регистрировали в 2013 году (Р = 2-50 %). При этом у гибрида Cara ½ Скэнт 3, обработанного фосфемидом в концентрации 0,01 %, отмечали их наименьшую распространенность (табл. 4).

4. Устойчивость исходных сортов и гибридной (F₄) формы яровой мягкой пшеницы ( Triticum aestivum L.) в поколениях М₁ и М₂ к основным фитопатоген-ным грибам при обработке семян фосфемидом в разных концентрациях (биостанция ТюмГУ «Озеро Кучак», Нижнетавдинский р-н, Тюменская обл., 2013-2014 годы; полевой опыт)

Образец	Концентрация фосфемида, %	Мучнистая роса		Бурая ржавчина		Пятнистости
		P, %	1 У	P, %	1   У	P, %	У
			М 1 (2013 год)
Cara	Контроль	0		0		30	Очень высокая
	0,002	0		0		5	Очень высокая
	0,01	0		0		10	Высокая
Cara ½ Cкэнт 3 Контроль		0		0		40	Высокая
	0,002	0		0		40	Очень высокая
	0,01	0		0		2	Очень высокая
Скэнт 3	Контроль	0		0		40	Высокая
	0,002	0		0		30	Высокая
	0,01	0		0		50	Высокая
			М 2 (2014 год)
Cara	Контроль	100	Высокая	50	Очень высокая	30	Очень высокая
	0,002	100	Высокая	50	Очень высокая	30	Очень высокая
	0,01	100	Низкая	100	Низкая	5	Очень высокая
Cara ½ Cкэнт 3 Контроль		100	Средняя	100	Очень высокая	5	Очень высокая
	0,002	100	Низкая	50	Очень высокая	10	Очень высокая
	0,01	100	Высокая	100	Низка я	3	Очень высокая
Скэнт 3	Контроль	100	Средняя	100	Низкая	5	Очень высокая
	0,002	100	Средняя	100	Низкая	5	Очень высокая
	0,01	100	Низкая	100	Низкая	10	Очень высокая
П р и м еч а ни е. Р — распространенность (встречаемость болезни); У — устойчивость							к заболеванию;
прочерк означает отсутствие заболевания.

Полное представление об устойчивости растений к листовым фитопатогенам можно получить при определении степени поражения и индекса развития болезни (R), рассчитанном на основе учета больных и здоровых растений и балла поражения. По индексу развития выделяли четыре группы устойчивости: очень высокая (R = 0-20 %), высокая (R = 21-40 %), средняя (R = 41-60 %), низкая (R = 61-80 %). У исходных сортов в М2 наблюдалось снижение устойчивости растений к возбудителям мучнистой росы и бурой ржавчины от высокой и средней в контроле до низкой в варианте с концентрацией мутагена 0,01 %; под влиянием высокой концентрации фосфемида восприимчивость гибрида к мучнистой росе снижалась, к бурой ржавчине — повышалась. К пятнистостям растения в контроле и после применения фосфемида проявили высокую и очень высокую устойчивость (см. табл. 4).

Обобщение результатов лабораторных и полевых экспериментов показало, что по количеству и разнообразию получаемых измененных форм мутагенная активность фосфемида сходна с таковой у супермутагенов нитрозоэтилмочевины и диметилсульфата в концентрациях 0,01; 0,02; 0,03 и 0,05 % (изучена нами ранее на трех сортах озимой пшеницы из Швеции — Truggve, WW 5530, WW 6110) (8). Полученные данные позволяют предположить, что фосфемид может использоваться в мутационной селекции яровой мягкой пшеницы. В целом значение метода экспериментального мутагенеза для расширения генетического разнообразия растений подтверждено созданием в мире свыше 3000 сортов разных культур (31).

Таким образом, на сортах и внутривидовом гибриде яровой мягкой пшеницы показана эффективность применения мутагена фосфемида в концентрациях 0,002 и 0,01 % для получения форм с измененными признаками. При обработке семян фосфемидом был отмечен жесткий ингибирующий эффект в отношении всхожести и морфометрических параметров у проростков, который зависел от дозы мутагена. Увеличивалась жизнеспособность растений в период вегетации. Гибридная форма Cara ½ Скэнт 3 576

имела преимущество перед исходными сортами по семенной продуктивности. В варианте с обработкой мутагеном концентрацией 0,01 % у нее повышалась устойчивость к поражению мучнистой росой. Гибрид характеризовался меньшей чувствительностью к мутагену в М1 и большей частотой и разнообразием измененных форм в М2 по сравнению с исходными сортами. Не выявлено четкой зависимости между восприимчивостью сортов и гибрида к фитопатогенным грибам и концентрацией фосфемида. Различия в реакции сортов и гибридной формы на воздействие мутагенного фактора обусловлены генотипическими особенностями исходных сортов, а также степенью гетерозиса и гетерозиготности гибрида. Положительным следствием этого может быть высокая адаптивность, обеспечивающая повышенную приспособленность к неблагоприятным условиям окружающей среды у создаваемых сортов пшеницы.