Основы маркерной селекции, трансгенез. Рубрика в журнале - Сельскохозяйственная биология
Статья научная
Использование лентивирусных векторов для генетической модификации эмбриональных клеток кур рассматривается в качестве одного из перспективных способов получения трансгенной сельскохозяйственной птицы. При этом встает вопрос об определении регуляторных элементов гена овальбумина, обеспечивающих тканеспецифичность и высокую экспрессию трансгена в клетках яйцевода кур. Целью настоящей работы стало изучение влияния последовательностей в составе интрона и промотора гена овальбумина на тканеспецифичность и экспрессию трансгена. Мы получили 5 экспрессирующих конструкций на основе лентивирусного вектора pWpxl, где маркерный ген eGFP был поставлен под контроль модифицированных регуляторных элементов гена овальбумина. В состав вектора pW2.8 входил хромосомный фрагмент ДНК размером 2,8 т.п.н., включавший первый экзон, интронную последовательность, а также часть второго экзона гена овальбумина; в состав вектора pW1.2 - хромосомный фрагмент ДНК длиной 1,2 т.п.н., включавший промотор и последовательность (без интрона и первого экзона) гена овальбумина до точки инициации транскрипции; в векторы pW131, pW225, pW315 - хромосомный фрагмент ДНК, аналогичный фрагменту 1,2 т.п.н. в векторе pW1.2, в котором промоторная часть (80 п.н.) была заменена соответственно на 131, 225 или 315 п.н. высокоструктурированной последовательности промоторной области гена β-актина птиц. Контрольный вектор pWCAGgfp включал конститутивный гибридный регуляторный элемент, содержащий энхансер ранних генов цитомегаловируса человека и промотор гена β-актина птиц (CAG). В качестве клеток-мишеней для трансфекции использовали первичную культуру клеток яйцевода кур и клетки фибросаркомы человека 293Т (контроль). Вирусный препарат вносили в концентрации 1-3x107 КОЕ/мл по достижении клетками монослоя. Экспрессию eGFP определяли флуориметрически через 72 ч после трансфекции. В условиях in vitro на культуре клеток яйцевода кур и клеточной линии 293Т была подтверждена низкая степень экспрессии гена eGFP, контролируемого хромосомным фрагментом 2,8 т.п.н. из лидерной области гена овальбумина: экспрессия рекомбинантного белка оказалась в 25 раз ниже, чем в случае вектора pWCAGgfp с конститутивным промотором CAG. При этом степень экспрессии eGFP для конструкций pW2.8 и pW1.2 была идентичной, что свидетельствует об отсутствии влияния интрона на экспрессию рекомбинантной ДНК с использованием этого регуляторного элемента. При замене промотора гена овальбумина на высокоструктурированные элементы конститутивного промотора гена β-актина отмечалось увеличение экспрессии eGFP в 2-3 раза, а также наблюдалось усиление экспрессии по мере удлинения промоторной области гена β-актина (векторы pW131, pW225, pW315). Экспрессия, достигнутая с использованием экзогенного промотора гена β-актина, была сопоставима с контролируемой конститутивным промотором CAG, однако замена промоторной части гена овальбумина на экзогенный промотор (гена β-актина) приводила к дерегуляции тканеспецифичного выражения eGFP, что свидетельствует о том, что транскрипция с тканеспецифичного промотора гена овальбумина не может быть модулирована или активирована с помощью экзогенных энхансеров
Бесплатно
Статья научная
Разведение крупного рогатого скота, генетически устойчивого к заболеваниям, - перспективное направление для предотвращения распространения инфекционных болезней у домашних животных. Лейкемия - одно из частых заболеваний, вызывающих существенные экономические потери. В ряде исследований было показано, что полиморфизмы гена DRB3 в локусе лейкоцитарного антигена крупного рогатого скота ( BoLA ) ассоциированы с устойчивостью коров к персистентному лимфоцитозу (PL) - клинической форме проявления лейкемии. Аллели, связанные с чувствительностью к PL, как правило, превалируют в популяциях крупного рогатого скота, что может отражать их связи с показателями молочной продуктивности. Целью нашей работы стало исследование ассоциаций между генотипами локуса BoLA-DRB3 и показателями молочной продуктивности в российской популяции молочного скота. С использованием метода ПЦР-ПДРФ (полиморфизма длин рестрикционных фрагментов) выполнили генотипирование 171 быка-про-изводителя голштинской породы по DRB3. Идентифицированные аллели BoLA-DRB3 были разделены на три категории в соответствии с чувствительностью носителей к PL. Аллели DRB3.2*08, DRB3.2*16, DRB3.2*22 и DRB3.2*24 относились к ассоциированным с чувствительностью (S), аллели DRB3.2*11, DRB3.2*23 и DRB3.2*28 - с устойчивостью (R), остальные - к нейтральным (N). Однофакторный дисперсионный анализ показал значимое влияние генотипа по гену DRB3 на изучаемые показатели ( F = 7,0-19,3; P
Бесплатно
