Agromyces sp. IBRB-34DCP - новый штамм-деструктор фенола и 2, 4-дихлорфенола

Среди многочисленной группы токсичных синтетических соединений, поступающих в окружающую среду со стоками и отходами, существенное место занимает фенол и его галогениды [1, 2].

Судьба загрязнителей ароматического ряда в окружающей среде в значительной степени зависит от метаболической активности микроорганизмов [3]. Показано, что почвобитающие микроорганизмы – главные агенты детоксикации и утилизации загрязнителей. Микроорганизмы способны минерализовать от 10 до 70% общего объема поступающих в окружающую среду ксенобиотиков путем включения их в нормальные биосферные метаболические циклы [4-6].

Цель настоящей работы – выявить характеристики нового природного штамма-деструктора фенола и 2,4-дихлорфенола Agromyces sp. IBRB-34DCP.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлся штамм Agromy-ces sp. IBRB-34DCP. Штамм был выделен из образца смешанных популяций микроорганизмов, подвергавшихся воздействию факторов нефтехимического производства.

Посевной материал бактерий получали выращиванием в разбавленном мясопептонном бульоне (1МПБ:7Н 2 О) при температуре +30^оС. Далее культуру засевали в количестве 0,01% от объема в жидкую минеральную среду следующего состава в г/л: NH 4 Cl – 1; K 2 HPO 4 – 5; MgSO 4 ⋅ 7H 2 O – 0,05; FeSO 4 ⋅ 7H 2 O – 0,005; CuSO 4 ⋅ 5H 2 O – 0,001; ZnSO 4 – 0,008; pH – 6,8 - 7,0. В данную минеральную среду

объемом 100 мл в качестве единственного источника углерода и энергии вносили фенол и 2,4-ДХФ в концентрации 100 мг/л. Суспензии инкубировали в термостатированных орбитальных встряхивате-лях УВМТ-12-250 при 115-120 об/мин. Рост культур контролировали по значению оптической плотности клеточной массы при длине волны 590 нм на фотоколориметре КФК-2.

Определение количества фенолов в культуральной жидкости проводили согласно стандартного фотометрического метода [7]. Для анализов отбирали 5 мл культуральной жидкости, которую освобождали от клеток бактерий центрифугированием при 5 тыс. об. / мин в течение 30 мин. Далее к пробе последовательно добавляли 30 мкл 2% раствора 4-аминоантипирина, 100 мкл 2 н раствора аммиака и 100 мкл 2 % раствора калия железосинеродистого. Смесь перемешивали после добавления каждого компонента реакции и через 10 мин измеряли коэффициент пропускания на фотоколориметре КФК-2 при длине волны 540 нм. Концентрацию фенолов определяли по градуировочному графику, построенному в стандартных условиях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Среди микроорганизмов, способных к деградации хлорированных производных фенола, особое место принадлежит бактериям, которые часто способны трансформировать несколько органических соединений.

В ходе настоящей работы на селективных средах был выделен штамм Agromyces sp. IBRB-34DCP – деструктор фенола и 2,4-дихлорфенола. Идентифицирование изолята проводили согласно признакам культурально-морфологической и физиолого-биохимической дифференциации [8].

Культура Agromyces sp. IBRB-34DCP при росте на МПА образовывала колонии лимонно - желтого цвета пастообразной консистенции. После снятия колоний петлей в агаре оставался четкий след в виде пятна. Клетки, составлявшие колонии, имели форму палочек и положительную окраску по Гра- му. Для штамма был характерен аэробный рост в диапазоне температур от +22°С до +41 °С, с оптимумом pH среды - 6,8, использование в качестве источника углерода глюкозы, галактозы, рамнозы, маннозы и ксилозы и отсутствие каталазной и оксидазоной активности.

Штамм способен использовать в качестве источника углерода и энергии фенол и дихлорфенол. Динамика роста и минерализации фенола и его хлорированных производных культуры Agromyces sp. IBRB-34DCP в модельных условиях приведены на рис. (А, В). Из рисунка видно, что Agromyces sp IBRB-34DCP накапливает массу клеток в условиях использования фенола в качестве источника пита- ния и энергии в периодической культуре в течение шести суток. Значение оптической плотности клеточной суспензии достигало максимума (0,13 ОЕ) и в дальнейшем оно плавно снижалось. Концентрация фенола менялась к 3-м суткам на 44%, к 9-м -на 74% от исходного значения.

На среде с 2,4-ДХФ изменение значений оптической плотности отмечалось с первых суток культивирования Agromyces sp IBRB-34DCP. Максимальное значение составляло на 7-е сут инкубации 0,2 ОЕ, затем после 3-суточной стационарной фазы культура заканчивала свой рост. Количество 2,4-ДХФ уменьшалось к 3-м сут на 45%, к 9-м – на 73% от начального состояния.

Рис. Зависимость значений оптической плотности клеточной суспензии OD 590 (А) и динамика содержания субстратов в среде культивирования (В) от времени инкубации Agromyces sp IBRB-34DCP в условиях использования фенола и 2,4-ДХФ в качестве источников углерода и энергии

Полученные данные показывают, что штамм Agromyces sp IBRB-34DCP способен утилизировать фенол и 2,4-ДХФ в водной среде. Из приведенного видно, что уровень ассимиляции фенола и 2,4-ДХФ штамма Agromyces sp IBRB-34DCP в ходе культивирования был примерно одинаков (73-74%).

На аэробных бактериях ранее было показано, что микроорганизмы, способные использовать молекулы фенола и его хлорированных производных в качестве единственного источника углерода и энергии относятся к родам Arthrobacter [9], Bacillus [10], Pseudomonas [11], Rhodococcus [12], Sphingo-monas [13] и, несмотря на то, что бактерии рода Agromyces широко распространены и очень многочисленны в почве, ранее не было упоминаний о том, что представители рода Agromyces способны вовлекать в обмен веществ ксенобиотики ароматического ряда, содержащие хлор.

В результате данного исследования выделена новая культура рода Agromyces. Установлено, что штамм Agromyces sp IBRB-34DCP может утилизировать фенол и 2,4-ДХФ. Приведенные характеристики показали, что применение культуры Agromy- ces sp IBRB-34DCP может позволить существенно снизить концентрацию фенола и его хлорпроизвод-ных в водной среде.

Работа выполнена при поддержке гранта Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Живая природа: современное состояние и проблемы развития» и государственного контракта № 14.512.11.0077 ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы».