Аэробное целлюлозолитическое сообщество ассоциантов сфагнового мха Sphagnum fallax как основа в процессах деструкции пожнивных остатков

В настоящее время в сельскохозяйственной практике остро стоит проблема утилизации отходов сельскохозяйственного производства, в частности особенно актуальными остаются вопросы переработки стерни и соломы зерновых культур. Общая масса получаемой соломы злаковых в мире оценивается в 2900 млн т (1), причем большая ее часть сжигается, что значительно загрязняет окружающую среду и запрещено законом во многих странах, в том числе в России. Показано, что к наиболее эффективным и безопасным способам переработки стерни злаковых относится ее деструкция с использованием микробиологических препаратов (2-4).

Ранее нами отмечалось, что сфагновые мхи служат уникальными местообитаниями для микроорганизмов (5), которые могут быть перспективны для сельскохозяйственной биотехнологии (6, 7). Кроме того, имеются сведения о присутствии представителей Actinobacteria и Strepto-myces , которые активно осуществляют деструкцию природных полимеров, в том числе целлюлозы, в составе торфяных отложений сфагновых болот (8, 9).

Цель настоящей работы — выделение бактериальных ассоциантов сфагновых мхов, обладающих целлюлозолитической активностью, и изучение влияния этих микроорганизмов на процессы разложения растительных остатков и баланс гумуса в почве.

Методика. Ассоциацию целлюлозолитических бактерий выделяли из образцов сфагновых мхов Sphagnum fallax (H. Klinggr.) H. Klinggr., ранее отобранных в районе оз. Волоярви (Ленинградская обл.) (7). Для изоляции бактерий использовали метод накопительных культур в жидкой среде Гетченсона (10) с pH 5,0. Для этого 3-5 растений мха, отмытых в стерильном физиологическом растворе, тщательно перетирали в асептических условиях с добавлением 10 мл физраствора до кашицеобразного состояния. Затем по 1 мл полученной растительной массы вносили в колбы с 50 мл среды Гетченсона и складчатым фильтром из фильтровальной бумаги. Посевы инкубировали стационарно 14 сут при температуре 20 ° C, периодически встряхивая, и отмечали изменения в структуре складчатого фильтра. По результатам роста в накопительной культуре отобрали один образец, у которого наблюдалась максимальная степень разложения фильтровальной бумаги.

При определении стабильности целлюлозолитической ассоциации провели 10 последовательных пассажей культуры, для чего по 100 мкл первоначальной суспензии вносили в колбы с 200 мл среды Гетченсона с добавлением 5 г измельченной фильтровальной бумаги и инкубировали 7 сут при 20 ° C с аэрацией (220 об/мин), отмечая изменения в цвете и консистенции фильтровальной бумаги.

Полученную культуру, представляющую собой смесь бактериальной массы и остатков полудеградированых волокон целлюлозы, исследовали под микроскопом («Ломо», Россия) в живых и окрашенных препаратах (10). Целлюлазную активность сообщества определяли по методике Кассана (11) в сравнении с обладающей целлюлазной активностью жидкой культурой Bacillus subtilis 4-13 из коллекции лаборатории технологии микробных препаратов Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ). Для разделения ассоциации и выделения доминантных форм чистых культур суспензию методом последовательных серийных разведений высевали на поверхность агаризованой среды Гетченсона с 1 % микрокристаллической целлюлозы и инкубировали 7 сут при 20 ° C. Колонии бактерий отсевали на свежие чашки Петри и в пробирки со скошенным агаром и описывали культурально-морфологические свойства полученных изолятов. Их физиолого-биохимические признаки исследовали методом мультисубстратного анализа с применением системы GEN III Microplate («BioLog», США).

Для молекулярно-генетической идентификации чистых культур доминантных изолятов бактериальную ДНК выделяли с помощью стандартного метода (лизис лизоцимом и SDS с последующей экстракцией с помощью фенола и хлороформа). Фрагмент гена 16S-рРHК амплифицирова-ли с использованием праймеров BD1/FD1 (12), ампликоны после очистки из геля секвенировали согласно протоколу фирмы «Beckman Coulter» (США) для 8-канального секвенатора SEQ8000 с коммерческим набором SEQ Dye Terminator Cycle Sequencing (DTCS) with Quick Start Kit.

Видовую принадлежность изолятов определяли с помощью программы BLAST GenBank .

Влияние целлюлозолитической ассоциации на процессы разложения растительных остатков и баланс гумуса в почве исследовали в микрополевом опыте, заложенном осенью 2011 года после уборки ярового ячменя (сорт Зазерский 85) на опытном поле Всероссийского научно-исследовательского, конструкторского и проектно-технологического института органических удобрений и торфа (ВНИИОУ) согласно схеме: 1 — без удобрений (контроль); 2 — солома ячменя (5 т/га); 3 — солома ячменя

(5 т/га) + N₅₀; 4 — солома ячменя (5 т/га) + N₅₀ + препарат баркон (ВНИИСХМ) (13-15); 5 — солома ячменя (5 т/га) + N₅₀ + культура B . sub-tilis 4-13; 6 — солома ячменя (5 т/га) + N₅₀ + культура ЦМА. Опыт закладывали на двух полях, площадь опытной делянки 3,36 м² (2,1*1,6 м), повторность опыта 4-кратная. Почва участка дерново-подзолистая супесчаная. В эксперименте использовали солому ячменя с опытного поля ВНИИОУ. Солому после уборки зерна измельчали (размер фрагментов 1-3 см) и равномерно распределяли по делянке вручную из расчета указанной выше дозы. После этого по поверхности соломы распределяли компенсирующую дозу азота (N₅₀) в виде аммиачной селитры и изучаемые культуры микроорганизмов согласно схеме опыта. В тот же день (28 августа 2011 года) обработанную таким образом солому равномерно заделывали в почву на глубину 0-20 см (модель зяблевой вспашки).

Для оценки влияния применяемых культур микроорганизмов на скорость трансформации соломы и показатели плодородия дерново-подзолистой почвы изучали минерализационные потери (эмиссию CO2 из пахотного слоя почвы) — абсорбционным методом по И.Н. Шаркову каждые 7 сут (16); численность основных физиологических групп микроорганизмов (ФГМ) — посевом почвенной суспензии на агаризованные и жидкие питательные среды (10); содержание микробной биомассы (Смик) — методом регидратации-экстракции (17); динамику содержания азота — по ГОСТ (18); нитрифицирующую способность (НС) — по методу Крав-кова; актуальную (полевую) целлюлозолитическую активность — по доле (%) разложенной целлюлозы; содержание углерода, экстрагируемого горячей водой (Сэгв), — согласно описанию (17). Учет величины и структуры урожая у ярового сорта тритикале Амиго и статистическую обработку полученных данных выполняли по Б.А. Доспехову (19). Углерод микробной биомассы определяли в динамике после заделки соломы ячменя (с 6 сентября по 9 ноября 2011 года) и в течение вегетационного периода 2012 года (с 4 мая по 6 сентября).

Результаты. Методом накопительной культуры в жидкой минеральной среде с добавлением целлюлозы была выделена целлюлозолитическая микробная ассоциация, которая через 14 сут инкубации практически

А

Б

Рис. 1. Аэробная целлюлозолитическая ассоциация микроорганизмов, выделенная из тканей сфагнового мха Sfagnum fallax (H. Klinggr.) H. Klinggr.: A — колонизация бактериями волокон целлюлозы, Б — жидкая культура целлюлозолитической микробной ассоциации на 14-е сут роста; 1 — активно развивающиеся целлюлозолитические микроорганизмы, 2 — остатки деградированного целлюлозного волокна. Неокрашенный препарат; световая микроскопия, увеличение *1000.

полностью разрушала структуру субстрата и изменяла его физические свойства; в результате сама накопительная культура представляла собой смесь культуральной жидкости желтого цвета и остатков целлюлозных волокон. Дальнейшее микроскопическое исследование накопительной культуры показало, что целлюлозные волокна активно колонизируются комплексом микроорганизмов, представленных разными морфологическими типами, основу которого составляют грамотрицательные неспорообразующие палочки различной морфологии (рис. 1).

В результате ряда последовательных пересевов с культивированием в аэробных условиях в жидкой среде с периодическим встряхиванием было установлено, что изучаемая культура стабильна и активно деградирует целлюлозные волокна, разрушая структуру целлюлозного фильтра и окрашивая культуральную жидкость в желтый цвет. Сравнительный тест на целлюлазную активность в агаризованной среде выявил, что диаметр зоны деградации целлюлозы в варианте с исследуемой ЦМА составляет 70 мм, в то время как для контрольной культуры B . subtilis 4-13 он не превышал 30 мм.

Методом последовательных серийных разведений с высевом на ага-ризованную среду Гетченсона с 1 % микрокристаллической целлюлозы ассоциацию разделили на пять доминантных бактериальных изолятов (каждый способен расти в чистой культуре), и их культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства были охарактеризованы (табл. 1). По результатам молекулярно-генетической идентификации установлено, что в состав сообщества входят следующие микроорганизмы, различающиеся по таксономическому положению: B . cereus , Variovorax sp., Delftia sp., Flavobacterium sp., Rhodococcus erythropolis .

1. Физиолого-биохимические свойства доминантных компонентов изучаемой целлюлозолитической микробной ассоциации, выделенной из образцов сфагнового мха Sphagnum fallax (H. Klinggr.) H. Klinggr.

Характеристика	1з is	8 ■g	A U	S 1 Ьч К U	S е*
Рост при pH 5,0	+	+	+	+	+
Рост при 1 % NaCl	+	+	+	+	+
Оптимум t, °С	28	28	28	28	28
Разжижение желатина	+	-	-	+	-
Усвоение углеводов и их производных:
целлюлоза	-	-	-	+	+
декстрин	+	±	-	+	-
D-мальтоза	+	-	-	+	-
D-трегалоза	+	-	-	-	+
D-целлобиоза	+	-	-	+	-
гентиобиоза	+	-	+	+	-
сахароза	+	-	-	+	+
D-тураноза	+	-	-	-	±
D-рафиноза	-	-	-	+	-
D-лактоза	-	-	-	-	-
D-мелибиоза	±	-	-	+	-
a-D-глюкоза	+	+	-	+	-
D-манноза	-	+	-	+	-
D-фруктоза	+	+	+	+	+
D-галактоза	-	+	+	+	-
D-фруктоза	+	+	+	-	-
Ь-фруктоза	+	+	+	+	-
Ь-рамноза	+	+	-	+	-
инозин	+	+	-	-	-
D-сорбитол	-	+	+	-	+
D-маннитол	-	+	-	-	+
D-арабитол	-	+	-	-	+
глицерол	+	+	-	-	+
инозитол	+	-	-	-	+
пектин	+	-	-	+	+

Продолжение таблицы 1

Усвоение аминокислот: D-аспарагин -         + + + + D-серин +         - - + - Ь-аланин, Ь-аргинин +        + + - + Ь-аспарагин +         - - + + Ь-глутамин +        + + + - Ь-гистидин +        + + + + Ь-серин Усвоение органических кислот: +        + - - + галактуроновая +         - + + + галактоновая -         + - - - глюконовая +        + + - + глюкуроновая +        + + + - глюкуронамид +        + + - - муциновая -          - + - - хинная +        + + - + молочная +        + + + + лимонная +        + + + + а-кетоглутаровая +        + + - - яблочная +        + + - + ацетоуксусная +        + + - + пропионовая +        + + - + уксусная +        + + + + муравьиная +        + + - ± Примечание. «+» — проявление признака, «-» — отсутствие проявления признака, «±» — частичное проявление признака.

Данные, полученные в микрополевом опыте с применением культуры изучаемого целлюлозолитического сообщества, а также B. subtilis 4-13 и микробного препарата баркон, свидетельствовали об их влиянии на про цессы гумификации и минерализации соломы в почве, что позволяет дать обоснованную агроэкологическую оценку эффективности использования соломы зерновых совместно с микробными культурами в специализиро ванном зерновом севообороте.

Рис. 2. Динамика содержания микробной биомассы (С_мик) в пахотном слое дерново-подзолистой супесчаной почвы в зависимости от варианта использования соломы ячменя (сорт Зазерский 85) в сочетании с исследуемыми микробными культурами : 1 — без удобрений, 2 — солома 5 т/га, 3 — солома 5 т/га + N₅₀, 4 — солома 5 т/га + N₅₀ + препарат баркон, 5 — солома 5 т/га + N₅₀ + Bacillus subtilis 4-13, 6 — солома 5 т/га + N₅₀ + целлюлозолитическая микробная ассоциация (ЦМА), выделенная из образцов сфагнового мха Sphagnum fallax (H. Klinggr.) H. Klinggr. (микрополевой опыт, Владимирская обл., 2011-2012 годы).

Микробная биомасса может служить важным показателем, характеризующим биологическое состояние пахотных почв и отражающим влияние агротехнических факторов. Согласно результатам анализа, динамика содержания микробной биомассы (Смик) в пахотном слое почвы на делянке имела следующие особенности (рис. 2). Все варианты с применением культур микроорганизмов на 10-е сут после заделки соломы превосходили по величине Смик контроль на 15-30 %. В последующие два срока наблюдений (13 ок тября и 9 ноября) в этих вариантах поддерживались более высокие показатели с максимальными значениями в 5-м и 6-м вариантах (в среднем

529-541 мг/кг почвы, что на 10-13 % выше, чем в варианте, когда в почву вносили неинокулированую микробами солому). Осенью после уборки тритикале наибольшим содержанием углерода микробной биомассы С_мик также характеризовались 5-й и 6-й варианты (соответственно с культурой B. subtilis 4-13 и ЦМА).

Рис. 3. Кумулятивные кривые эмиссии СО₂ (С-СО 2 ) в зависимости от варианта использования соломы ячменя (сорт Зазер-ский 85) в сочетании с исследуемыми микробными культурами : 1 — без удобрений, 2 — солома 5 т/га, 3 — солома 5 т/га + N₅₀, 4 — солома 5 т/га + N₅₀ + препарат баркон, 5 — солома 5 т/га + N₅₀ + Bacillus subtilis 4-13, 6 — солома 5 т/га + N₅₀ + целлюлозолитическая микробная ассоциация (ЦМА), выделенная из образцов сфагнового мха Sphagnum fallax (H. Klinggr.) H. Klinggr. (микрополевой опыт, Владимирская обл., 2011-2012 годы).

Наблюдения за размерами эмиссии СО2 из почвы в динамике, начиная с 1-х сут после заделки соломы с биологическими препаратами, и расчет кумулятивных кривых эмиссии двуокиси углерода по вариантам опыта (рис. 3) показали, что за период наблюдений (63 сут) минимальное количество СО2 выделилось из почвы в контроле (вариант без удобрений, 72,5 г/м2). При внесении соломы анализируемый показатель возрос в 1,5 раза (до 109,42 г/м2). Добавка компенсирующей дозы минераль ного азота к соломе способствовала увеличению эмиссии углерода до 139,32 г/м2. Все использованные в опыте культуры микроорганизмов про явили высокую эффективность в отношении интенсификации разложения растительной биомассы соломы, что зафиксировано по увеличению объемов выделения СО2. За срок наблюдений в вариантах с внесением культур микроорганизмов объемы выделившегося CO2 были в сумме на 32-58 % выше, чем в случае, когда солому не инокулировали микроорганизмами и не добавляли компенсирующую дозу азота, и на 4-24 % выше по сравнению с вариантом, когда солому вносили совместно с N50. Согласно полученным данным, по интенсивности влияния на минерализационные потери СО2 в проведенном опыте культуры микроорганизмов можно расположить в последовательности: B. subtilis 4-13 > ЦМА > микробный препарат баркон.

Экспериментальные данные, полученные при исследовании дина мики содержания минерального азота в пахотном слое, свидетельствовали, что при добавлении компенсирующей дозы азота этот показатель значительно превышал контроль во все сроки отбора проб. Следует отметить вариант с применением ЦМА, в котором анализируемый показатель во все сроки оставался наибольшим. В результате изучения динамики численности ФГМ, участвующих в круговороте углерода и азота, было установлено, что инокуляция культурами микроорганизмов и заделка соломы значительно увеличивают популяцию агрономически полезных групп микроорганизмов, особенно по данным на 9 ноября 2011 года. При использовании ЦМА наблюдался существенный рост численности аммонифицирую- щих и амилолитических микроорганизмов, которая была максимальной в указанном варианте опыта (табл. 2).

2. Показатели биологического состояния дерново-подзолистой супесчаной почвы в зависимости от варианта использования соломы ячменя (сорт Зазер-ский 85) в сочетании с исследуемыми микробными культурами (микрополевой опыт, Владимирская обл., 2011-2012 годы)

Вариант	Численность микроорганизмов, тыс. КОЕ/г почвы						Км
	1 h S	h S £ 5 &	1 S О Д « о О R   Д § 1 § Bog V Ц S У У У	О Л	& В S д	8 s = и
Без удобрений	7934	17333	25,0	49,5	7,4	250 25	2,29
Солома 5 т/га	17834	24700	36,7	73,7	15,5	1500 150	1,43
Солома 5 т/га + N 50	24767	40767	45,9	126,0	18,2	950 450	1,68
Солома 5 т/га + N 50 + препарат баркон	18100	37167	37,7	92,2	31,3	45000 25	2,08
Солома 5 т/га + N 50 + Bacillus subtilis Ч-13	15700	28534	30,9	109,5	24,2	4500 250	1,81
Солома 5 т/га + N 50 + целлюлозолитиче-	47734	81000	38,2	100,2	24,6	250	1,73
ская микробная ассоциация (ЦМА)						95
Примечание. Км — коэффициент минерализации (над чертой —				через 3	мес, под	чертой —	че-
рез 1 год). ЦМА выделена из образцов сфагнового мха Sphagnum fallax (H. Klinggr.) H. Klinggr.

Проведенный микробиологический анализ показал, что, несмотря на общее снижение численности выявляемых ФГМ (по сравнению с осенними сроками определения), в вариантах с применением культур микроорганизмов суммарная биологическая активность была выше, чем при заделке неинокулированной соломы. При использовании ЦМА отмечались более высокие значение коэффициента минерализации Км. Через 1 год после внесения соломы и культур микроорганизмов (3 октября 2012 года) различия в интенсивности микробиологических процессов нивелировались по всем вариантам, но анализируемый показатель оставался на 2839 % выше, чем в варианте без удобрений.

При проведении анализов определение общей численности протеолитических почвенных микроорганизмов на МПА было дополнено учетом r-стратегов, быстро развивающихся за счет легкодоступных соединений. Их относительно высокая доля от общего числа выделяемых на МПА микроорганизмов, которую мы отмечали в вариантах с культурами B . subtilis Ч-13 (52 %) и ЦМА (46 %), может свидетельствовать о более активном освоении внесенного органического субстрата и энергично протекающих процессах минерализации.

Влияние обработки соломы культурой целлюлозолитической микробной ассоциации отразилось на содержании углерода, экстрагируемого горячей водой (С_эгв). Наблюдалась тенденция к увеличению этого показателя весной 2012 года (4 мая) в вариантах с внесением инокулированной соломы по сравнению с вариантами, где послеуборочные остатки не инокулировались микробными культурами. В почве, отобранной после уборки тритикале, различия по вариантам не зафиксировали. При учете урожайности ярового сорта тритикале не выявили достоверных различий по вариантам опыта. Можно отметить тенденции к снижению урожайности при заделке соломы без компенсирующей дозы азота и к увеличению урожайности при использовании ЦМА и B. subtilis Ч-13 и (табл. 3).

• 3.    Урожайность тритикале (яровой сорт Амиго) в зависимости от варианта использования соломы ячменя (сорт Зазерский 85) в сочетании с исследуемыми микробными культурами (микрополевой опыт, почва дерново-подзолистая супесчаная, Владимирская обл., 2012 год)

• 11.    Kasana R., Sal wan R., Dhar H., Dutt S., Gulati A. A rapid and easy method for the detection of microbial cellulases on agar plates using Gram’s iodine. Curr. Microbiol., 2006, 57(5): 503-507.

• 12.    Коростик Е.В., Пинаев А.Г., Ахтемова Г.А., Андронов Е.Е. Универсальные 16S рРНК праймеры BD1 для описания генетического разнообразия сообщества почвенных прокариот. Экологическая генетика, 2006, 4(4): 32-37.

• 13.    Русакова И.В., Воробьев Н.И. Способ эффективного использования соломы в качестве удобрения с применением биопрепарата Баркон. Владимир, 2010.

• 14.    Русакова И.В., Воробьев Н.И. Использование биопрепарата Баркон для иноку-лирования соломы, применяемой в качестве удобрения. Достижения науки и техники АПК, 2011, 8: 25-28.

• 15.    Русакова И.В., Воробьев Н.И. Влияние биопрепарата Баркон на процессы гумификации соломы. Агрохимия, 2011, 1: 48-55.

• 16.    Шарков И.Н. Определение интенсивности продуцирования СО₂ почвой адсорбционным методом. Почвоведение, 1984, 7: 136-143.

• 17.    Казеев К.Ш., Колесников С.И., Вальков В.Ф. Биологическая диагностика и индикация почв: методология и методы исследований. Ростов-на-Дону, 2003.

• 18.    ГОСТ 26107-84 Почвы. Методы определения общего азота. М., 1984.

• 19.    Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). М., 1985.

Вариант	Урожайность, г/м2	Изменение урожайности
		г/м2	%
Без удобрений	150
Солома 5 т/га	143	-7	-5
Солома 5 т/га + N 50	158	+8	+5
Солома 5 т/га + N 50 + препарат баркон	158	+8	+5
Солома 5 т/га + N 50 + Bacillus subtilis Ч-13	164	+14	+9
Солома 5 т/га + N 50 + целлюлозолитическая
микробная ассоциация (ЦМА)	168	+18	+12
НСР „5	29,4

Примечание. ЦМА выделена из образцов сфагнового мха Sphagnum fallax (H. Klinggr.) H. Klinggr.

Таким образом, в условиях микрополевого опыта (2011-2012 годы) выделенная нами целлюлозолитическая микробная ассоциация (ЦМА) показала эффективность в отношении ускорения минерализации и гумификации пожнивных остатков ячменя, внесенных в пахотный слой дерново-подзолистой супесчаной почвы в качестве удобрения, что было зарегистрировано по следующим изменениям показателей: по увеличению численности микроорганизмов — деструкторов свежего органического вещества; по увеличению коэффициента минерализации; по росту содержания микробной биомассы, увеличению эмиссии СО2, повышению актуальной целлюлозолитической активности; по увеличению содержания легкоразла-гаемого органического вещества. Активность ЦМА была максимальной в начальные сроки после инокуляции и заделки соломы в почву.