Актинобактерии термального источника Еро (Монголия)

Актинобактерии — это грамположительные бактерии с высоким содержанием гуанина+цитозина и могут быть представлены как нитчатыми, так и формами, не образующими нити, некоторые могут продуцировать споры на различных этапах онтогенеза. По современной классификации филум Actinobacteria включает 6 классов, 6 отрядов, 14 подотрядов и 56 семейств [J.Wink, F. Mohammadipanah 2017]. Количество интродуцированных родов этого таксона и их физиологическое разнообразие предполагает, что таксономическая идентификация этой группы будет динамичным процессом в будущем. Актинобатерии могут быть представлены как сапрофитами, так и патогенными микроорганизмами. Благодаря большому разнообразию ферментных комплексов и антибактериальному потенциалу актинобактерии используют в медицине, промышленности и энергетике и для решения проблем окружающей среды [J.Wink, F. Mohammadipanah 2017]. Экологическая роль актинобактерий в природных системах заключается в разложении сложных устойчивых субстратов, в то же время из-за медленного роста они неспособны конкурировать с немицелиальными бактериями за легкодоступные вещества. Представители рода Nocardia способны осуществлять процессы хемосинтеза, окисляя водород, метан и метанол. Среди актиномицетов широко распространена гетеротрофная фиксация CO ₂ [Ю.Н. Горелов и др, 2012].

Микробные сообщества в горячих источниках широко изучаются с использованием как культурально-зависимым, так и культурально-независимым подходом. Так использование методов высокопроизводительного секвенирования 16S рРНК оказалось многообещающим инструментом для исследования популяционного разнообразия и экологической значимости микробных сообществ, обитающих в различных горячих источниках. Использование культурально-зависимого подхода необходим для изоляции и идентификации бактерий с высоким биотехнологическим потенциалом. Исследование рассматриваемого горячего источника Еро с использованием культурально-независимого и культурально-зависимого подходов расширят данные по таксономическому разнообразию актинобактерий.

Материал и методика

Объектом исследования является горячий источник Байкальской рифтовой зоны — Еро (Монголия) с диапазоном температур от 36,3 °С до 42,9 °С. Источник расположен на северо-западном склоне Хэнтэйского хребта, в 150 км к северу — северо-востоку от г. Улан-Батор, в труднодоступной горно-таёжной местности, на левом берегу р. Ара-Ичильхэ, GPS: 49°01'122 " c. ш., 107°32'727 " в. д. [Оргиль-янов, 2021].

Накопительную культуру актинобактерий культивировали на среде состава (г/л): NH ₄ Cl — 0,3; KH ₂ PO ₄ — 0,3; MgCl ₂ — 0,3; CaCl ₂ — 0,3; дрожжевой экстракт — 0,5. В качестве источника азота использовали триптон в конечной концентрации 1,5%. Оптимальные значения рН ^25С роста бактерий устанавливали карбонат-бикарбонатным буфером до рН 8,5–9,0. Посевы осуществляли методом предельных разведений (1:10), аэробно, в термостате Binder (Германия). Культуры инкубировались при 45°С в течение трех суток.

Таблица 1

Физико-химическая характеристика источника Еро (апрель, 2019)

Станция	Т, 0С	рН	М, мг/л	Eh, мВ	СО32-,мг/л	НСО3-, мг/л
Еро-1	42.9	9.27	232	-241	30	30.5
Еро-2	41.2	9.34	232	-237	36	24.4
Еро-3	40.9	9.92	233	-119	30	36.6
Еро-4	36.3	9.48	236	-99 - -101	36	18.3

Для выделения чистой культуры из отдельной колонии накопительной культуры высевали поверхностным способом в стерильные чашки Петри с агаризованной средой. Изолированные колонии пересевали вновь. Чистоту выделенных культур проверяли микроскопированием по однородности клеток. Микроскопирование культур проводили с помощью микроскопа Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия) при увеличении 1000 раз в фазовом контрасте на окрашенных препаратах по Граму.

Исследование таксономического состава микробного сообщества проводились с помощью высокопроизводительного секвенирования фрагментов генов 16S рРНК. Проведена качественная и количественная характеристика состава бактериальных сообществ донных осадков и микробных матов в горячем источнике Еро. Секвенирование продуктов амплификации выполняли в ЦКП «Персистенция микроорганизмов» (г. Оренбург).

ДНК выделяли с помощью набора PowerSoil DNA Isolation Kit (Mo-Bio). Регион V3-V4 гена 16S рРНК был амплифицирован с помощью праймеров 343F (5’-CTCCTACGGRRSGCAGCA-3’) and 806R (5’-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3’), содержащих адаптерные последовательности (Illumina), линкер и баркод. Биоинформатическая обработка включала перекрывание парных ридов, фильтрацию по качеству и длине, учет одинаковых последовательностей, отбрасывание синглетонов, удаление химер и кластеризацию, и получение OTU. Таксономическая принадлежность последовательностей OTU определялось с помощью RDP classifier 2.11 [Wang et al., 2007].

Результаты и обсуждение

Д ля изучения состава микробного сообщества источника Еро было проведено высокопроизводительное секвенирование по гену 16S рРНК. По результатам секвенирования показано, что микробное сообщество донных осадков источника Еро характеризовалось значительным видовым разнообразием бактерий, в составе которых выявлено до 349 филотипов (OTU), принадлежащих 32 филумам. Определено от 37 132 до 55 196 последовательностей, бактерии составляют до 98,45% микроорганизмов в донных осадках станции Еро-19-3 и 98,73 % микроорганизмов в осадках станции Еро-19-2. В источнике Еро микробные сообщества донных осадков четырех станций сходны по наличию представителей основных филумов бактерий. От 50,5% до 93,68% всех последовательностей микробного сообщества донных осадков четырех станций составляют 5 филумов Proteobacteria, Cyanobac-teria/Chloroplast, Chloroflexi, Nitrospitae и Un с lassified_Bacteria, доля последних составляет от 8,45 до 28,9% от всех последовательностей. В донных осадках обнаружены последовательности до 1,44%, относящиеся к Archae.

Наибольшее количество нуклеотидных последовательностей в сообществе микробных матов принадлежало представителям следующих таксонов: Proteobacteria, Cyanobacteria/Chloroplast, Chloroflexi, и Unсlassifi ed_Bacteria . Чуть менее половины последовательностей (47,98%) в станции Еро-19-2 относится к Unсlassifi ed_Bacteria.

Микробное сообщество воды источника Еро отличалось доминированием двух филумов Proteobacteri а и Actinobacteria . Эти филумы составляют более 92% состава микробного сообщества воды станций Еро-19-1, Еро-19-2 и Еро-19-4 . Станция Еро-19-3 отличается наименьшим разнообразием актинобактерий. Доминируют Proteobacteri а (61,72%) остальные последовательности составляют филумы Bacteroidetes, Cyanobacteria/Chloroplast, Firmicutes, Ignavibacteriae, Unсlassifi ed_Bacteria , Verrucomicrobia и Nitrospirae.

Nocardioidaceae

Acidimicrob ineae_incertae_sedis

• ■    Conexibacteraceae

unclassified_Soliinbrobacterales lamia ceae

• ■    Micrococcaceae

unclassifiedJ'Acidimicrobineae"

• ■    Nakamuiellaceae

• ■    Gai ellaceae

• ■    Coryneb acteriaceae

• ■    Acidimicrob ineaeinceitaesedis

• ■    S anguib a cterac eae Acidimicrob iaceae Nocardioidaceae

• ■    My cobacteriaceae Patulibacteraceae

• ■    Gai ellaceae

• ■    Conexibacteraceae

• ■    unclassified-" Actinobacteria"

• ■    Micromonosporaceae

• ■    Gai ellaceae

• ■    Streptomycetaceae

• ■    Acidimicrob iaceae

• ■    unclassifiedFrankineae

• ■    Nocardiaceae

• ■    unclassifiedS olitubrobacterales

• ■    Nocardioidaceae

• ■    Nocardiaceae

• ■    Nocardioidaceae

• ■    Geodermatophilaceae

• ■    Cellulomonadaceae

• ■    Nocardioidaceae

• ■    Nocardioidaceae

• ■    Nocardioidaceae

• ■    Nocardiaceae

• ■    Nocardioidaceae

• ■    Nocardioidaceae

Рис. 1. Разнообразие филума Actinobacteria в воде термального источника Еро на уровне семейства

В микробных матах содержание актинобактерий, в зависимости от выходов, составляет от 1,1–1,3%. Разнообразие класса актинобактерий, составляют порядки Acidimicribiales, Gaiellales, Coriobacteriales и unclassifi edActinibacteria . Acidimi-crobiales включает в себя семейства Lamiacea, Acidimicrobinaeae_incertae_sedis и unclasiffied_Acidimicrobinae. Gaiellales имеет только семейство Gaiellaceae , представленные одним родом — Gaiella . Порядок Coriobacteriales представлен семейством Corioba c teriaceae , с единственным родом — unclassifiedCoriobacte-riaceae . Семейство Lamiacea состоит только из рода — Aquihabitans .

Таксономический анализ актинобактерий в донных осадках показал, что видовой состав на уровне порядка существенно отличался от таксономического разнообразия воды и микробных матов (рис. 3).

Рис. 2. Разнообразие филума Actinobacteria в микробных матах термального источника Еро на уровне семейства

Gaiel 1 aceae

• ■    Micromonosporaceae unclassified" Acidimicrobineae" unclassified_Actinomycetales Gaiellaceae

• ■    Acidimicrobineae_incertae_sedis

• ■    unclassified_Rubrobacteridae

• ■    lamiaceae

• ■    Coriobacteriaceae

• ■    Coriobacteriaceae

• ■    Acidimicrobineaeincertaesedis

• ■    Coriobacteriaceae

• ■    unclassified" Actinob acteria"

• ■    Acidimicrobineae_incertae_sedis

• ■    unclassified" Acidimicrobineae"

• ■    unclassified" Actinob acteria"

• ■    Micrococcaceae

Рис. 3. Разнообразие филума Actinobacteria в донных осадках термального источника Еро на уровне семейства

В данных осадках филум актинобактерий представлен следующими порядками: Acidimicrobiales, Actinomycetales, Gaiellales и Coriobacteriales. Из всех последовательностей представленных Actinobacteria в донных осадках на долю неклассифицируемых приходится от 67,5 до 81,8% (от всех последовательностей, отнесенных к филуму Actinobacteria). Высокий процент неклассифицируемых актинобактерий в донных осадках горячего источника Еро представляет собой новый и неиспользованный ресурс видового разнообразия и требует дальнейшего изучения.

Из термального источника Еро (Монголия) была выделена одна монокультура бактерии. Штамм был выделен из накопительной культуры донных осадков станции Еро-19-3. Культура представлена тонкими, но длинными и извитыми бактериями, которые могут сцепляться друг с другом и образуют длинную цепь, размеры которой достигали около 0,8 мкм, также имеет клеточные образования — жгутики. Структура клеточной стенки изолята имеет грамположительный тип. На агаризованной среде штамм образует округлые темно-оранжевые колонии диаметром 2–3 мм, с ровными краями и гладкой блестящей поверхностью. Данная бактерия довольно плохо культивируется, требует специальной техники пересева. В результате определения таксономической принадлежности бактерии на основании морфологических признаков и микроскопических методов культура отнесена к представителям рода Nocardia , класса Actinobacteria (рис. 4). При определении и описании культуры учитывали следующие характеристики: форма и окраска, наличие дополнительных образований, количество клеток в колониях, особенности ветвления и другие характеристики. Выделенный штамм бактерии является умеренным термофилом с оптимумом роста 45 °С.

Рис. 4. Актинобактерия, род Nocardia , предположительно Nocardia farcinica

Всего в мире насчитывается более 80 видов нокардий и около 33 видов, являются условно-патогенными организмами [Wink, 2012].

Таким образом, изучено таксономическое разнообразие актинобактерий в составе микробного сообщества в горячем источнике Еро (Монголия). Показано, что доля актинобактерии в сообществе варьировала, в зависимости от биотопа: вода, донные осадки и микробные маты. Следует отметить, что в микробном сообществе горячего источника Еро обнаружена высокая доля неклассифицируемых бактерий. Впервые в горячем источнике Монголии была выделена чистая культура филума Actinobacteria .