Активация синтеза внеклеточного матрикса дермы после термического ожога

Могильная Г.М., Фомичева Е.В., Евглевский А.А. Активация синтеза внеклеточного матрикса дермы после термического ожога. Морфологические ведомости. 2023;31(1):691. (1).691

Mogilnaya GM, Fomicheva EV, Evglevskiy AA. The activation of the dermis extracellular matrix synthesis after the thermal burn. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological newsletter. 2023;31(1):691. (1).691

Введение. Стадийность репарации кожи после ожоговой травмы описана в литературе достаточно подробно и постулируется как многоступенчатый процесс, включающий в себя такие фазы, как воспаление, пролиферация и ремоделирование [1–3]. Каждая из названных фаз протекает с участием различных клеток дермы, что приводит к формированию определенного морфологического градиента [4–8]. При этом началом процесса регенерации считается эффект «закрытия» фибробластами раневого повреждения путем синтеза ими экстрацеллюлярного матрикса дермы (далее - ЭЦМ). Введение в медицинскую практику современных методов лечения ожоговых травм с использованием биоинженерных заменителей кожной и клеточной терапии оставляют за собой проблему, связанную с восстановленными участками кожи, которые отличаются от здоровой степенью организации коллагеновой сети, не соответствующей здоровой дерме, а также отсутствием эластина, придатков кожи и полноценного эффекта дифференцировки фибробластов в миофибробласты и изменением характера ремоделирования дермы с формированием грубого рубца [9–15]. Для решения этой проблемы могут быть использованы препараты, способные восстанавливаться естественную архитектуру дермы. Такой подход представляется перспективным, ибо соответствует современной концепции регенеративной медицины, предлагающей использовать для реконструкции органов и тканей собственные ресурсы организма [16–18].

Целью исследования является изучение морфологических преобразований дермы в зоне ожога с использованием биодеградируемого инъекционный препарата-импланта на основе гидроксиапатита кальция «Radiesse», выступающего в роли динамичного и мультифункцио-нального регулятора клеточной активности дермы.

Материалы и методы исследования. Экспериментальное исследование выполнено на 30 самцах беспородных крыс массой 200–250 грамм. Животных содержали в виварии с регулируемым световым режимом и свободным доступом к пище и воде, что соответствует ГОСТу РФ 330442014 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Содержание и дизайн исследований согласованы с локальным этическим комитетом Кубанского госмедуни-верситета (протокол № 54 от 11.10.2017). Исследование проводилось в течение 4 месяцев. Для моделирования ожоговой раны использовали латунный цилиндр с площадью рабочей поверхности 706 мм2 и массой 300 грамм, нагретый до 100 градусов в кипящей воде. Цилиндр прикладывался рабочей поверхностью к депилированной коже животного в области холки на 15 секунд, что обеспечивало формирование ожога III-й степени. Для анестезии использовали ингаляционный наркоз. Всех животных после ожога разделили на две группы: контрольную (10 животных) и опытную (20 животных). В рамках протокола эксперимента на 14 день после нанесения ожога крысам опытной группы вводили препарат «Radiesse». Введение филлера проводили субдермально в объеме 0,05 мл на границе визуально определяемой интактной кожи. Этот день считали точкой отсчета эксперимента. В группе контрольных животных использовали стерильный физиологический раствор.

Объектом морфологического и иммуногистохимического анализа явились фрагменты кожных покровов в центре раневого дефекта и в участках неповрежденной кожи по краям ожоговой раны. Биологический материал забирали в сроки, соответствующие 2 и 4 месяцам. Из парафиновых блоков препаратов кожи изготавливали серийные срезы толщиной 4–5 микрон с использованием ротационного микротома. Для оценки морфологического состояния зоны ожога срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по Маллори, Массону и Ван-Гизон. Для избирательного выявления коллагенов использованы иммуногистохимические тесты с антителами к коллагену І и ІІІ типов. Общее содержание коллагена определяли путем компьютерной морфометрии срезов, окрашенных по Маллори. Полученные изображения подвергали морфометрии c использованием программы ImageJ, при этом измеряли площадь, занятую цветным продуктом химической реакции, соответствующую сум- марному содержанию коллагена. Результаты измерений выражали в квадратных мегапикселях. Величину структурной тканевой энтропии определялся по масштабированным до формата 640×480 мегапикселей микрофотографиям с использованием 16-цветной палитры [19]. Все данные подвергались статистической обработке. Проверку характера распределения вариационных рядов производили с помощью параметрического критерия Пирсона. Во всех исследованных вариационных рядах значения асимметрии и эксцессов немного отличались от нуля, поэтому можно было считать, что распределения показателей являются нормальными. Учитывая близость распределений значений к нормальному, дополнительно проводили сравнение средних величин по критерию Стьюдента на уровне различий р<0,05. Влияние фактора ожога на различие значений показателей по времени проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа по критерию Фишера на уровне различий р<0,001.

Результаты исследования и обсуждение. Проведенная нами сравнительная морфологическая характеристика изменений, наблюдаемых в дерме в ответ на введение препарата и после его двухмесячного пребывания в дерме показало наличие импланта, окруженного соединительнотканной капсулой. Имплант выглядит в виде совокупности микросфер округлой или овальной формы, ограниченных тонкими фибриллами и одним слоем плоских оксифильно окрашенных клеток. Содержимое микросфер отсутствует, лишь изредка в них определяется мелкодисперсная масса. Между микросферами визуализируется небольшое число клеток, окрашивающихся базофильно и оксифильно. Окраска по Маллори позволяет увидеть коллагеновые волокна, последних в зоне ожога достаточно много, они формируют пучки, местами разделенные миофибробластами и гладкомышечными клетками. Зона импланта сохранена и содержит много микросфер, вокруг каждой из них определяется интенсивно окрашенная капсула и содержимое микросфер (рис. 1). Клетки между микросферами округлой формы, некото- рые из них имеют пенистую цитоплазму (рис. 2). Эпидермис через 2 месяца после нанесения ожога восстановливает свою целостность и насчитывает от 5 до 6 четко дифференцированных слоев (рис. 3).

Рис. 1. Микрофото препарата кожи зоны импланта через 2 месяца после введения филлера. Окр. гематоксилином и эозином. Ув.: ×400

Рис. 2. Микрофото препарата кожи зоны импланта через 2 месяца после введения филлера. Окр. по Маллори. Ув.: ×400

Рис. 3. Микрофото препарата кожи зоны введения импланта через 2 месяца. Окр. по Маллори. Ув.: ×400

При сравнении микропрепаратов кожи животных экспериментальной группы с пролонгированным до 4-х месяцев сроком пребывания в зоне дермы филлера, окрашенных по Маллори также сохраняется высокий уровень содержания коллагена, формирующего уже параллельно ориентированные фибриллярные пучки (рис. 4). Между коллагеновыми фибриллами можно видеть значительное число миофибробластов. Поверхностный ком-партмент дермы содержит сместившиеся в эту зону концевые отделы сальных желез. Эпидермис на участке ожога гипертрофирован и насчитывает до 6–7 клеточных рядов, которые покрывают высокие сосочки), меняющие рельеф поверхности кожи (рис. 4).

Дерма в зоне сосочкового слоя характеризуется наличием большого числа фибробластов, располагающихся между плотно упакованными пучками коллагена (рис. 5). Участок импланта локально не выявлялся из-за его биодеградации. Использование окраски по Ван-Гизон и Массону подтверждает выявленный эффект активации неоколлагеногенеза к сроку пребывания филлера в дерме до 2-х месяцев и сохранение его объема с последующим увеличением в условиях пролонгирования воздействия филлера до 4-х месяцев.

Проведенная морфометрия объема фибриллярного компонента экстрацеллюлярного матрикса показала, что в срок, соответствующий двум месяцам после введения импланта происходит увеличение содержания коллагена в среднем на 61%. К 4му месяцу эксперимента уровень содержания коллагена становился выше исходного на 87%.

Для оценки характера структурной организации вновь синтезированного фибриллярного компонента ЭЦМ нами был использован показатель энтропии, который является мерой функциональной целостности ткани и неупорядоченности морфологических систем в условиях нормы и патологии, что позволяет проводить сравнения и судить о динамике процесса. Оказалось, что участок дермы, регенерированный без импланта имеет показатель энтропии 3,78±0,13, что указывает на его дезорганизацию. Введение импланта заканчивается синтезом участка ЭЦМ с коэффициентом энтропии 2,98±0,06, что можно интерпрети- ровать как эффект установления в этой зоне дермы морфофункциональной стабильности (рис. 6).

Рис. 4. Микрофото препарата кожи зоны введения импланта через 4 месяца. Окр. по Маллори. Ув.: х400

Рис. 5. Микрофото препарата кожи зоны введения импланта через 4 месяца. Окр. по

Маллори. Ув.: х400

Сроки исследования

Рис. 6. Динамика объема коллагена в экстрацеллюлярном матриксе и уровня структурной тканевой энтропии дермы в зоне термического ожога кожи контрольной и экспериментальной групп животных в различные сроки исследования

Изучение распределения коллагена с использованием иммуногистохимического метода позволило охарактеризовать типы синтезируемого коллагена. Так, оказалось, что имплант в срок, соответствующий двум месяцам, обеспечивает синтез коллагена I типа в количественном отношении больше обычного в 2 раза, что подтверждает эффект неоколлагеногенеза на фоне введения препарата. При этом наиболее высоким уровнем экспрессии проколлагена характеризуются клетки фибробласты. Отдельные участки аморфного компонента дермы окрашены диффузно и экспрессируют низкий уровень синтеза коллагена. В зоне импланта визуализируются микросферы, стенки их определяются за счет единичных, тонких, слабо окрашенных фибрилл. При выявлении коллагена I типа спустя 4 месяца после пребывания в зоне дермы импланта фибробласты выглядят более крупными с большим числом отростков, что указывает на активацию в них процесса экзоцитоза проколлагена. Повышение уровня экс- прессии коллагена I типа отмечается и в зоне ЭЦМ.

Коллаген III типа в срок, соответствующий 2 месяцам наблюдения, накапливается в дерме в большем количестве, чем коллаген I типа, в то же время зона экспрессии этих двух типов коллагена совпадает. Это, прежде всего, фибробласты, заполненные тропоколлагеном. Число этих клеток нарастает, но они мелкие, вытянутой веретеновидной формы с многочисленными отростками, заполненными секретом. В зоне импланта к этому сроку уровень экспрессии коллагена III типа умеренный. Обращает на себя внимание положительная реакция содержимого микросфер, которое выглядит в виде мелкодисперсной массы с умеренной экспрессией коллагена III типа. В условиях пролонгирования срока пребывания препарата филлера до 4 месяцев, уровень экспрессии коллагена III типа в зоне импланта не меняется, а в дерме над ним визуализируется большое число фибробластов с высоким уровнем экспрессии коллагена III типа.

Результаты наших экспериментов показали, что процесс регенерации ЭЦМ дермы, приуроченный к двум месяцам пребывания филлера в дерме, индуцирует эффект неоколлагеногенеза, регистрируемый при гистохимическом его выявлении по Маллори, при этом процесс неоколлагено-генеза с пролонгированным действием филлера до 4-х месяцев нарастает.

Дифференцированное выявление коллагенов I и III типов с использованием антител подтверждает активацию темпа неоколлагеногенеза фибробластами как дермы, так и импланта к концу второго месяца, причем этот факт прослеживается в распределении коллагена как I, так и III типа. Темп синтеза первого сохраняется достаточно высоким до 4-х месяцев пребывания филлера в дерме. Что же касается коллагена III типа, то отмечается усиление темпа синтеза его в зоне дермы к сроку, соответствующему 2-м месяцам, к 4-м месяцам синтез его в зоне импланта снижается. В самой дерме характер распределения коллагена III типа остается высоким и соответствует картине двух месяцев пребывания филлера в зоне ожога.

Заключение. Таким образом, полученные данные позволяют считать, что использование биодеградируемого препарата филлера на основе гидроксиапатита кальция «Radiesse» представляется перспективным для регенерации дермы после ожога и может обеспечить получение ЭЦМ дермы, имеющего состав и сборку коллагеновой сети, приближенной к естественной. Использование показателя энтропии подтверждает общность структурной организации дермы. Не исключено, что выявленный тип формирования ЭМЦ может обеспечить становление межклеточных коммуникаций для фибробластов, макрофагов и кератиноцитов, что обеспечит процесс модуляции синтезируемой дермы, аналогично имеющейся in vivо. Предлагаемая в эксперименте стратегия с использованием собственных клеток организма для синтеза внеклеточного матрикса, аналогичного естественному, может явиться альтернативой существующим методам лечения ожогов.