Активаторы плазминогена урокиназного и тканевого типов и их ингибитор при заболеваниях щитовидной железы

С помощью иммуноферментного анализа (ELISA) изучено содержание активаторов плазминогена урокиназного (uPA) и тканевого (tPA) типа и одного из их ингибиторов (PAI-1) в цитозольной фракции щитовидной железы 129 больных злокачественными и доброкачественными опухолями, а также различными неонкологическими заболеваниями этого оргaнa. B опухолях больных раком щитовидной железы выявлены самые низкие уровни tPA и наиболее высокие показатели uPA и PAI-1, тогда как для доброкачественных заболеваний щитовидной железы, включая аденому, были характерны высокие показатели tPA и относительно низкие значения uPA и PAI-1 в ткани пораженного органа. При этом наиболее низкие показатели uPA и PAI-1 выявлены у больных диффузным токсическим зобом как с аденоматозом, так и без него. Группы больных узловым коллоидным зобом по уровню uPA и PAI-1 занимали промежуточное положение между диффузным токсическим зобом и аденомой, с одной стороны, и раком щитовидной железы, с другой. Предполагается связь продукции uPA и PAI-1 с механизмами бластомогенеза щитовидной железы.

UROKINASE-AND TISSUE-LIKES PLASMINOGEN ACTIVATORS AND THEIR INHIBITOR IN THYROID DISEASES

N.E. Kushlinsky1, I.A. Kazantseva2, M.N. Sandybaev3, T.Yu. Kharitidi1,

O.S. Popov4, A.E. Tyleuov3, A.P. Kalinin2

N.N. Blokhin Cancer Research Center, RAMS, Moscow1

V.F. Vladimirsky Regional Research Clinical Institute, Moscow2

M. Ospanov Western-Kazakhstan State Medical Academy, Actyubinsk, Kazakhstan Republic3

Siberian State Medical University, Tomsk4

The levels of urokinase-and tissue-likes plasminogen activators (uPA and tPA) and their inhibitor PAI-1 in cytozol fraction of thyroid gland of 129 patients with malignant and benign tumors as well as with various non-oncological thyroid diseases were studied with the help of immunoenzymatic analysis (ELISA). The lowest tPA levels and the highest uPA and PAI-1 levels were revealed in tumors of thyroid cancer patients, while high levels of tPA and relatively low levels of uPA and PAI-1 were observed in thyroid tissue of patients with benign thyroid tumors including adenoma. The lowest uPA and PAI-1 levels were found in patients having Basedow’s disease both with adenomatosis and without it. For the groups of patients with adenomatous goiter, the uPA and PAI-1 levels showed intermediate state between Basedow’s disease and adenoma, on the one hand, and thyroid cancer, on the other hand. Levels of uPA and PAI-1 are suspected to correlate with the mechanisms of thyroid blastogenesis.

Одним из основных механизмов инвазии и метастазирования злокачественных опухолей является разрушение окружающей базальной мембраны и внеклеточного матрикса протеазами, ассоциирован- ными с опухолью [1, 3]. Центральную роль в этих процессах может играть сериновая протеаза - активатор плазминогена урокиназного типа (uPA), являющийся ключевым звеном протеолитического каскада, при- водящего к образованию плазмина, разрушающего компоненты опухолевой стромы [2]. Система активации плазминогена имеет также непосредственное отношение к процессам неоангиогенеза в опухолях [10]. Известно, что активность uPA регулируется несколькими путями и, в частности, подавляется двумя белковыми ингибиторами, принадлежащими к семейству серпинов (PAI-1 и PAI-2), а также "2-антиплазмином и нексином [4]. PAI-1 и PAI-2 эффективно ингибируют связанный с рецептором uPA, а "2-антиплазмин защищает находящийся на поверхности клетки плазмин от ингибирования [2,5]. Связывание PAI-1 и PAI-2 с комплексом uPA-рецептор приводит к интернализации ковалентных комплексов протеазы с ингибиторами, происходящей при участии рецептора "2-макроглобулина, после чего эти комплексы расщепляются внутри клетки.

Помимо uPA, в активации плазминогена в опухолях участвует также активатор плазминогена тканевого типа (tPA) [2]. B норме оба эти фермента являются компонентами фибринолитической системы, при этом tPA секретируется преимущественно эндотелиальными клетками, а uPA - клетками паренхимы. Оба ингибитора uPA эффективно действуют и на tPA.

Концентрации uPA и PAI-1, как правило, существенно выше в злокачественных опухолях, чем в доброкачественных и в нормальных тканях [6, 7]. Для tPA часто отмечается противоположное соотношение. Показано также, что при некоторых злокачественных новообразованиях, в частности при раке молочной железы, высокие уровни uPA и PAI-1 и низкий уровень tPA являются факторами неблагоприятного прогноза заболевания [5, 6, 9]. Роль системы активации плазминогена при злокачественных и доброкачественных заболеваниях щитовидной железы практически не изучена.

Цель настоящего исследование - сравнительное изучение содержания некоторых основных компонентов системы активации плазминогена, а именно, uPA, tPA и PAI-1 в цитозольной фракции опухолей и у больных с разными неонкологическими заболеваниями этого органа.

Материал и методы

Обследовано 129 пациентов (117 женщин и 12 мужчин, в возрасте от 40 до 52 лет) с заболеванием щитовидной железы. У всех диагноз установлен впервые и подтвержден данными морфологического ис- следования, что позволило выделить следующие 6 групп пациентов: 1) 19 больных (средний возраст 49,7 ± 3,2 года) – узловой коллоидный зоб с аденома-тозом или аденомой (УЗК с аденоматозом); 2) 41 (46,3 ± 2,5 года) – узловой коллоидный зоб без адено-матоза (УЗК без аденоматоза); 3) 8 (46,9 ± 4,4 года) – диффузный токсический зоб в сочетании с аденома-тозом (ДТЗ с аденоматозом); 4) 12 (40,7 ± 3,2 года) – диффузный токсический зоб без аденоматоза (ДТЗ без аденоматоза); 5) 35 (52,0 ± 2,5 года) – рак щитовидной железы (РЩЖ); 6) 14 (52,0 ± 3,4 года) – аденома щитовидной железы (AЩЖ). Концентрацию uPA, PAI-1 и tPA определяли в цитозолях, полученных по стандартной методике, используемой при определении рецепторов стероидных гормонов и разведенных в 10 раз K,Na-фосфатным буфером (14 мМ NaCl, 2,7 мМ KСl, 1,5 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, рН 7,4), содержащим 0,1 % Твин-20 и 1 % БСA. Определение проводили с помощью стандартных наборов реактивов для иммуноферментного анализа, разработанных в Католическом университете г. Наймеген (Нидерланды), как описано авторами [8]. Измерения проводили на автоматическом ридере для микроплашек ELх800 фирмы "Bio-Tek Instruments, Inc." (СШA) при 492/630 нм. Обработку результатов измерений проводили по формуле Y = a + bX + cX2, где X - концентрация анализируемого белка (нг/мл), Y – оптическая плотность при 492 нм. Концентрации анализируемых белков выражали в нг/мг цитозольного белка.

Результаты и обсуждение

Среди всех обследованных групп больных наиболее низкие показатели tPA были отмечены в цитозольной фракции РЖЩ (1,51 ± 0,22 нг/мг белка), при этом данный показатель был выявлен в 100 % опухолей. Однако следует отметить широкие пределы колебания уровней tPA в злокачественных опухолях щитовидной железы (0,19–5,32 нг/мг белка) (табл. 1).

Среди доброкачественных заболеваний щитовидной железы наиболее высокие значения tPA выявлены в цитозоле при УКЗ в сочетании с аденоматозом и ДТЗ без аденоматоза (3,54 ± 0,82 и 3,37 ± 0,75 нг/мг белка, соответственно) (табл. 1). Однако в цитозольной фракции образцов ткани при ДТЗ без аденома-тоза tPA выявлен только в 92 %. Не отмечено также достоверных отличий в уровне tPA между группами больных AЩЖ, УКЗ без аденоматоза и при ДТЗ с аденоматозом.

Н.Е. КУШЛИНСКИЙ, И.А. КАЗАНЦЕВА, М.Н. САНДЫБАЕВ И ДР.

Таблица 1

Уровни активатора плазминогена тканевого типа (tPA)* в цитозоле при раке и доброкачественных заболеваниях щитовидной железы

Группы обследованных больных	Число наблюдений	tPA выявлен, %	Пределы колебания tPA	Среднее значение tPA	Медиана tPA
1.УКЗ с аденоматозом или аденомой	95	18	0,16–15,30	3,54 ± 0,82	3,09
2.УКЗ без аденоматоза	98	40	0,15–11,12	2,46 ± 0,36	1,97
3.ДТЗ с аденоматозом	100	8	1,46–4,03	2,73 ± 0,31	2,64
4.ДТЗ без аденоматоза	92	11	0,52–9,30	3,37 ± 0,75	2,65
5.РЩЖ	100	35	0,19–5,32	1,51 ± 0,22	1,11
6.AЩЖ	100	14	1,10–4,77	2,31 ± 0,30	1,83

Примечание: * – концентрация tPA выражена в нг/мг белка.

Максимальные значения PAI-1 выявлены в цитозольной фракции при РЩЖ (0,91 ± 0,16 нг/мг белка), а близкими к этим значениям были показатели PAI-1 у больных УКЗ с аденоматозом и без такового (0,72 ± 0,18 и 0,72 ± 0,15 нг/мг белка соответственно) и

AЩЖ (0,68 ± 0,15 нг/мг белка). Среди обследованных цитозолей из тканей щитовидной железы PAI-1 выявлялся реже – в 88 % случаев и его самый низкий уровень обнаружен при ДТЗ с аденоматозом – 0,26 ± ±0,08 нг/мг белка (табл. 2).

Таблица 2

Уровни ингибитора активаторов плазминогена первого типа (PAI-1)* в цитозоле при раке и доброкачественных заболеваниях щитовидной железы

Группы обследованных больных	Число наблюдений	РАМ выявлен %	Пределы колебания РАМ	Среднее значение РАМ	Медиана РАМ
1 .УКЗ с аденоматоз ом или аденомой	7	89	0,13-2,66	0,72 ±0,18	0,43
2 .УКЗ без аденоматоза	40	98	0,06-4,60	0,72 ±0,15	0,31
З.ДТЗ с аденоматозом	7	88	0,05-0,63	0,26 ±0,08	0,21
4.ДТЗ без аденоматоза	11	92	0,15-1,551	0,51 ±0,13	0,26
5.РЩЖ	35	100	0,16-4,99	0,91 ±0,16	0,61
6.АЩЖ      Примечание: * –	концентрация	PAI-11 выраже	на в нг/мг белка.	0,6810,15	0,52

Следует отметить, что uPA был выявлен не во всех образцах исследованных тканей (от 86 до 95 %) и имел широкие пределы колебания от 0,15 до 15,3 нг/мл белка. Наиболее низкие средние показатели uPA отмечены в цитозольной фракции из тканей щитовидной железы при ДТЗ с аденоматозом (0,13 ± 0,02 нг/мг белка). Значения uPA, выявленные в этой группе больных, приближались к его показателям при ДТЗ без аденоматоза (0,17 ± 0,03 нг/мг белка) и AЩЖ (0,18 ± 0,02 нг/мг белка) и выявлены соответственно в 92 % и 86 % наблюдений. Самый высокий средний уровень uPA обнаружен при РЩЖ (0,69 ± 0,15 нг/мг белка). Не отмечено достоверных различий в показателях uPA при УКЗ с аденомато-зом и без него, а также между группами больных ДТЗ без аденоматоза и AЩЖ (табл. 3).

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что в опухолях больных РЩЖ выявлены самые низкие уровни tPA и наиболее высокие показатели uPA и PAI-1. Тогда как при доброкачественных заболеваниях щитовидной железы и для AЩЖ были характерны высокие показатели tPA и относительно низкие значения uPA и PAI-1 в цитозольной фракции пораженного органа. При этом наиболее низкие уровни uPA и PAI-1 выявлены в цитозольной фракции тканей щитовидной железы у больных ДТЗ как с аденоматозом, так и без него. По показателям uPA и PAI-1 УКЗ в сочетании с аденоматозом и без него ближе стоит к группе больных РЩЖ, отличаясь от последней только высокими показателям tPA.

Таблица 3

Уровни активатора плазминогена урокиназного типа (uPA)* в цитозоле при раке и доброкачественных заболеваниях щитовидной железы

Группы обследованных больных	Число наблюдений	Bыявлен-ный uPA, %	Пределы колебания uPA	Среднее значение uPA	Медиана UPA
1 .УКЗ с аденоматозом или аденомой	17	89	0,16–15,30	0,29 ± 0,08	0,17
2.УКЗ без аденоматоза	39	95	0,15–11,12	0,28 ± 0,05	0,18
3.ДТЗ с аденоматозом	7	88	1,46–4,03	0,13 ± 0,02	0,11
4.ДТЗ без аденоматоза	11	92	0,52–9,30	0,17 ± 0,03	0,13
5.РЩЖ	32	91	0,19–5,32	0,69 ± 0,15	0,32
6.AЩЖ	12	86	1,10–4,77	0,18 ± 0,02	0,19

Примечание: * – концентрация uPA выражена в нг/мг белка.

B злокачественных опухолях щитовидной железы также выявлено значительное снижение уровней tPA, по сравнению с AЩЖ, УКЗ и ДТЗ. Группы больных узловым коллоидным зобом по уровню uPA и PAI-1 занимали промежуточное положение между ДТЗ, AЩЖ и РЩЖ, что позволяет предположить большую вероятность малигнизации этих узловых новообразований. Это подтверждают наблюдения ряда авторов о том, что в при РЩЖ фоновым процессом в большинстве наблюдений были узловые образования в органе.

Таким образом, представленные в настоящем исследовании данные позволяют предполагать возмож- ную связь основных компонентов системы активации плазминогена, а именно uPA, tPA и PAI-1, с процессами бластомогенеза при РЩЖ. Кроме того, эти результаты подтверждают потенциальную возможность использования изученных показателей для оценки риска малигнизации при гиперплазии и доброкачественных опухолях щитовидной железы.