Активность антиоксидантных ферментов у разных видов моллюсков в условии гипоксии / аноксии

биомаркеров стресса, вызванного гипокси-ей/аноксией [10].

В данной работе на 5 видах моллюсков, характеризующихся различной устойчивостью к недостатку кислорода, исследовалась активность 3 антиоксидантных ферментов (супероксиддис-мутазы (СОД), каталазы (КАТ), глутатионредук-тазы (ГР)) в условии гипоксии/аноксии. Цель данного исследования состояла в выявлении особенностей изменения активности антиоксидантных ферментов у моллюсков при недостатке кислорода.

Материалы и методы. В работе были использованы двустворчатые моллюски – мактра сахалинская ( Spisula sachalinensis ) , мидия Грея ( Crenomytilus grayanus ) , приморский гребешок ( Patinopecten yessoensis) и брюхоногие моллюски – литторина маньчжурская ( Littorina mand-schurica ) , тегула простая ( Tegula rustica ) . Экспериментальную аноксию создавали при выдерживании моллюсков S. sachalinensis и C. grayanus на воздухе с принудительно сомкнутыми створками раковин [4] в течение 24 часов, P. yessoensis выдерживали на воздухе в течение 20 часов, L. mandschurica и T. rustica выдерживали на воздухе в течение 30 часов. Моллюсков выдерживали на воздухе при температуре равной температуре морской воды на момент отбора. Ткань пищеварительной железы гомогенизировали в 0.05 М Трис-НСl буфере, рН 8.0, содержащем 0,1 мМ фенилметансульфонилфторид, и центрифугировали в течение 40 мин при 10 000 об/мин. при + 4°С. Активность СОД определяли по ингибированию реакции окисления НАДН, вызванного супероксидным радикалом [7]. Активность КАТ определяли по реакции разложения перекиси водорода [8]. Активность ГР определяли по реакции восстановления окисленной формы глутатиона. В качестве восстановителя использовали НАДФН [8].

Все цифровые данные представляют собой среднее значение для четырех проб ± стандартное отклонение (M±m). Для двустворчатых моллюсков каждая проба – отдельная особь, для брюхоногих – объединение ткани от 10 особей. Статистическая обработка материалов выполнена с использованием статистических средств приложения MS Office Excel. О достоверности изменений исследуемых параметров судили по различиям средних значений, используя критерий Стьюдента. В расчетах принят 5% уровень значимости.

Результаты и обсуждение. Результаты экспериментов показали, что при гипок-сии/аноксии не наблюдалось однотипного изменения активности антиоксидантных ферментов для всех видов моллюсков (табл. 1). Можно выделить 3 способа изменения активности (реагирования) антиоксидантных ферментов при ги-поксии/аноксии: 1) увеличение, 2) снижение, 3) поддержание активности на прежнем уровне (табл. 2).

Первый способ реагирования (увеличение активности АО ферментов) наблюдался у S. sa-chalinensis и L. mandschurica. Данные виды отличались от остальных повышением активности СОД (в 3 и 2 раза, соответственно) и ГР (в 2 и 1.5 раза, соответственно). Известно, что супероксид-дисмутаза является одним из главных ферментов антиоксидантной защиты, обезвреживающий супероксидный анион радикал (О2.-), который образуются при восстановлении молекулярного кислорода в процессе аэробного метаболизма. А глутатионредуктаза является ферментом, восстанавливающим дисульфидную связь окисленного глутатиона (важного внутриклеточного антиоксиданта). По-видимому, особые условия существования этих видов являются причиной периодичного усиления продукции АФК в тканях пищеварительной железы. Так, мактра сахалинская временно закапывается в грунт и, таким образом, оказывается в условиях гипоксии/аноксии. А литторина маньчжурская подвержена постоянному ежедневному изменению условий обитания на литорали, что связано с фазами прилива и отлива. Вероятно, процесс повышения активности данных антиоксидантных ферментов при гипок-сии/аноксии в экспериментальных условиях у данных видов протекает на основе их способности быстро реагировать на повышенную индукцию АФК. Эти моллюски адаптированы к постоянной смене условий существования и адаптация, возможно, заключается в изменении активности антиоксидантных ферментов.

Таблица 1. Изменения в активности АО ферментов при гипоксии/аноксии в тканях пищеварительной железы моллюсков (M±m)

Примечание: СОД – супероксиддисмутаза, КАТ – каталаза, ГР – глутатионредуктаза; К – контроль, Г/А – гипоксия/аноксия; * – достоверные различия относительно контроля (n=4, р<0.05).

Второй способ реагирования (снижение активности АО ферментов) наблюдался у P. yes-soensis – активность ферментов СОД и ГР была подавлена на 25% и 30%, соответственно. Приморский гребешок является стенооксифильным, чувствительным к недостатку кислорода видом, обитающим в относительно стабильных условиях сублиторали, и благодаря активному передвижению может уходить в более благоприятные места при гипоксии/аноксии. Вероятно, поэтому гребешок не был способен ни к усилению, ни к поддержанию активности АО ферментов на обычном уровне в стрессовых условиях гипок-сии/аноксии. Возможно также, что у приморского гребешка по сравнению с другими исследованными нами видами антиоксидантные ферменты оказались менее устойчивыми к изменению внутриклеточной среды при недостатке кислорода.

Таблица 2. Направленность реагирования АО ферментов пищеварительной железы моллюсков на условия гипоксии/аноксии

Примечание: ↑ - достоверное увеличение активности фермента, ↓ - достоверное снижение активности фермента, ↔ - поддержание активности фермента на прежнем уровне

Третий способ реагирования (поддержание активности АО ферментов на прежнем уровне) наблюдался у C. grayanus и T. rustica , у которых активность ферментов оставалась неизменной при гипоксии/аноксии. Как мидия Грея, так и тегула простая являются эволюционноадаптированными к более постоянным условиям существования (оба вида обитают на сублиторали, ведут прикрепленный и малоподвижный образ жизни соответственно) и не испытывают резкой смены кислородного режима, как это наблюдается у литоральных и закапывающихся моллюсков. Вследствие этого, вероятно, они не способны к быстрому изменению активности антиоксидантных ферментов. Однако они способны поддерживать активность АО ферментов на нормальном (прежнем) уровне. Возможно также, что в тканях этих моллюсков при временном усилении образования АФК в условиях недостатка кислорода задействованы, главным образом, низкомолекулярные компоненты антиоксидантной защиты [6].

Выводы: наш эксперимент показал, что видовые различия в реагировании антиоксидантных ферментов моллюсков на условия гипок-сии/аноксии, вероятно, связаны с особенностями условий их существования. Данные эксперимента также подтверждают возможность использования антиоксидантных ферментов в качестве биохимических маркеров стрессового воздействия, в частности гипоксии/аноксии. Понимание всех возможных механизмов реагирования компонентов АО системы – важный шаг для дальнейших исследований в области прогноза выживаемости организмов при гипоксии/аноксии.