Активность ферментов антиоксидантной защиты и анаэробного гликолиза в условиях температурного градиента у палеарктического Lymnaea stagnalis

Одним из наиболее значимых факторов Распространенным методом оценки среды является температура, изменения которой состояния окружающей среды является могут негативно сказаться на жизнедеятельности изучение структуры и состава природных организмов. Особому влиянию изменения популяций. Однако, такие исследования температуры подвержены гидробионты, отражают уже причиненный экосистеме вред, в поскольку уровень их жизнедеятельности то время как молекулярные (биохимические) напрямую зависит от термальных характеристик индикаторы стрессовых состояний могут среды обитания (Константинов, 1986). обеспечить раннее обнаружение стрессового воздействия.

Целью настоящего исследования была оценка активности ферментов антиоксидантной системы (пероксидазы, каталазы, глутатион S-трансферазы) и анаэробного гликолиза (лактатдегидрогеназы) в условиях температурного градиента у палеарктического Lymnaea stagnalis .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования были выбраны палеарктические брюхоногие моллюски, получившие широкое распространение в Прибайкальском регионе - Lymnaea stagnalis (Linnaeus,1758). Данный вид широко распространён не только в водоемах Палеарктики, но и населяет ряд изолированных мелководных заливов (соров) Байкала. Представители L. stagnalis предпочитают заросшие участки водоемов, встречается на растениях, вблизи от поверхности воды (Беркин и др., 2009; Тимошкин, 2009).

Гастроподы были собраны в водоеме, расположенном в черте г. Иркутска (N 52°26.83’, E104°28.13’). Перед экспериментом гастропод содержали в аэрируемых термостатах при температуре +6 (±0,5) °С в течение 7 суток. Содержание в лабораторных условиях не являлось стрессовым, гибель моллюсков в это время не отмечали. Во всех экспериментах использовали здоровых и активных особей.

В экспериментальном исследовании проведена экспозиция гастропод в условиях градиентной гипертермии от 6°С (средняя температура среды водоема, в котором проводили отлов моллюсков) до температуры, при которой отмечали гибель 50% особей (30°). Скорость изменения температуры составила

1оС•ч-1. Фиксацию материалов проводили в жидком азоте каждые 5°С (5 часов). Контрольные образцы зафиксированы непосредственно перед экспериментом при температуре акклимации (6°С).

Оценку активности ферментов антиоксидантной системы (пероксидазы, каталазы и глутатион S-трансферазы) проводили согласно модифицированным спектрофотометрическим методикам Drotar (1985), Aebi (1984) и Habig (1974) соответственно (Тимофеев, 2006; 2010). Определение активности лактатдегидрогеназы проводили энзиматическим спектрофотометрическим методом с применением стандарт-набора «ЛДГ-витал» (Vital-Diagnostics Spb).

Измерения проводили на спектрофотометре Cary 50 (Varian, США) при λ=340 нм для пероксидазы и лактатдегидрогеназы, при λ=240нм для каталазы и при λ=436 нм для глутатион S- трансферазы. Все эксперименты проведены в 5 биологических параллелях. Биохимический анализ каждой пробы проведен в 3-х аналитических измерениях. Оценку достоверности проводили, используя двувыборочный u-критерий Манна-Уитни. Статистический анализ проводили с использованием программы Statistica 8.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты проведенного исследования представлены на рис. 1. Согласно полученным данным, активность пероксидазы у палеарктического L. stagnalis в контрольной группе составила 0,29 ±0,03 нКат/мг белка. В условиях повышения температуры среды у L. stagnalis отмечали повышение активности до

0,45 ±0,051 нКат/мг белка при достижении температуры среды 30°С.

Активность каталазы в контрольных образцах L. stagnalis составила 369,32 ±50,07 нКат/мг белка. При воздействии повышенной температуры на гастропод, у L. stagnalis происходило снижение активности каталазы при 10°С до 156,1 ± 45,14 нКат/мг белка и при 25-30°С до 179,6 ± 48,38 нКат/мг белка.

Как следует из представленных материалов, у L. stagnalis активность глутатион S-трансферазы в контрольных образцах составила 19,7±2,16 нКат/мг белка. При экспозиции гастропод L. stagnalis в условиях температурного градиента наблюдали увеличение активности фермента относительно контрольных значений при повышении температуры с 15 до 30°С. Максимальная активность глутатион S-трансферазы составила 26,5±2,39 нКат/мг белка и была отмечена при достижении температуры 25°С.

Согласно полученным материалам по оценке активности лактатдегидрогеназы, в контрольных образцах у палеарктического L. stagnalis активность фермента составила 0,017 ± 0,003 нКат/мг белка. Максимальная активность лактатдегидрогеназы - 0,024 ± 0,002 нКат/мг белка отмечена при температуре 20°С, после чего происходило снижение активности фермента до контрольных значений.

Таким образом, в работе показано, что в условиях температурного градиента у исследуемых гастропод происходят изменения активности ферментов антиоксидантной системы и анаэробного гликолиза. При гипертермии у L. stagnalis происходит повышение активности пероксидазы, лактатдегидрогеназы и глутатион S-трансферазы, и снижение активности каталазы. Это свидетельствует об активации антиоксидантой системы, необходимой для элиминации активных форм кислорода, интенсивно образующихся при стрессовых условиях. Причины снижения активности каталазы у палеарктического L. stagnalis, учитывая экологические характеристики вида и высокие показатели терморезистентности, вероятно связанны с попыткой организма перейти на менее энергозатратные механизмы поддержания жизнедеятельности.

Повышение температуры приводит к ряду структурно – функциональных перестроек клеточных мембран, что сопровождается накоплением вторичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ -триеновых коньюгатов, альдегидов и кетонов), на что косвенно указывает увеличение активности фермента глутатион-S-трансферазы у L. stagnalis. Это вероятно свидетельствует об усилении выведения токсичных продуктов ПОЛ, и поддержании внутриклеточной защиты от повреждения мембран (Pennec, 2003).

Повреждение мембран напрямую влияет на состояние энергетического обмена организмов. Так, при нарушении структуры мембран обеспечение работы электрон-транспортной цепи митохондрий становится невозможно, что заставляет организмы переходить на менее эффективные метаболические пути получения энергии. В частности – путь анаэробного гликолиза, одним из маркеров которого является активность фермента лактатдегидрогеназы. Увеличение активности лактатдегидрогеназы, сопровождающееся накоплением лактата, указывает на интенсификацию утилизации лактата с целью получения энергии на фоне общего угнетения метаболизма. В текущей работе, на примере L. stagnalis показано, что переключение метаболизма с эффективного аэробного на менее эффективный анаэробный является компенсаторным механизмом получения энергии в условиях энергодефицита (Тимофеев, 2010).

установлено, что активность каталазы и лактатдегидрогеназы у L. stagnalis значительно ниже, а активность пероксидазы и глутатион S – трансферазы, напротив, значительно выше, чем у байкальского B. ongurensis . Вероятно, это может быть связано с контрастно отличающимися условиями обитания и экологическими характеристиками исследованных видов.

Из сравнения показателей активности у ранее

Таким образом, в работе показано, что исследованного байкальского Benedictia ферменты антиоксидантной системы ongurensis (Axenov-Gribanov et al., 2013) и у (пероксидаза, каталаза, глутатион S-палеарктического L. stagnalis установлено, что у трансфераза) и анаэробного гликолиза гастропод разных экологических групп (лактатдегидрогеназа) участвуют в механизмах отличаются базовые (контрольные) показатели стресс-адаптации у палеарктических гастропод

Рисунок 1. Активность ферментов антиоксидантной системы и анаэробного гликолиза у L. stagnalis в норме и при экспозиции в условиях температурного градиента (в нКат/мг белка).

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке грантов РФФИ (12-04-31767 мол_а, 12-04-90039 Бел_а, 12-04-98062-р_сибирь_а, 11-04-91321-СИГ_а), грантов Президента РФ МК-5466.2012.4, МД-2063.2012.4, ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», а также программы стратегического развития ИГУ. Авторы выражают особую благодарность Шахтановой Надежде Сергеевне за помощь в проведении данного исследования.