Активность ферментов дыхательной цепи митохондрий лейкоцитов крови в условиях токсического гепатита, индуцированного на фоне пищевого лишения белка

Метаболические превращения, происходящие в лейкоцитах периферической крови, отражают состояние обменных и регуляторных процессов в организме (Marchenko, Voloshchuk, 2014; Kramer et al. , 2014), а изучение активности отдельных звеньев энергетического обмена позволяет оценить эффективность функционирования системы биотрансформации энергии, обеспечивающей исполнение лейкоцитами своих функций. Полноценное функционирование системы энергообеспечения лейкоцитов является одним из необходимых условий эффективной работы системы иммунного надзора (MacIver et al. , 2008).

Центральными ферментами системы энергообеспечения лейкоцитов является NADH-убихинонредуктаза, маркер активности Комплекса I дыхательной цепи (Finel et al. , 1992), и сукцинатдегидрогеназа, ключевой фермент Комплекса II дыхательной цепи (Miles, 2003). NADH-убихинонредуктаза обеспечивает транспорт четырех протонов из матрикса в межмембранное пространство и восстановление убихинона (Sharova, Vekshin, 2004), сукцинатдегидрогеназа (сукцинат-КоQ-редуктаза) обеспечивает функционирование дополнительного пути для входа электронов в дыхательную цепь за счет окисления сукцината (Jones, Hirs, 2013).

На сегодня остается открытой и требует подробного изучения проблема биохимических механизмов формирования дисбаланса системы биотрансформации энергии в клетках иммунной системы в условиях лекарственного гепатита, формирующегося в условиях алиментарного дефицита белка.

Цель исследований – определение активности NADH-убихинонредуктазы [КФ 1.6.5.3] и сукцинатдегидрогеназы [КФ 1.3.5.1] митохондрий лейкоцитов в условиях ацетаминофен-индуцированного гепатита на фоне алиментарной депривации протеина.

MATERIALS AND METHODS

Исследования проводили на 27 белых нелинейных крысах массой 90-100 г и возрастом 22,5 месяца. Работу с животными осуществляли с учетом положений Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг.

Крыс содержали по одной в пластмассовых клетках с песчаной подстилкой, доступ к воде ad libitum . Нормирование суточного рациона проводили с учетом принципа парного питания.

Исследования проводили на 3 группах животных: 1 – контроль (К); 2 – крысы с острым ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащиеся на полноценном рационе (Г); 3 – крысы с ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащиеся в условиях алиментарной депривации протеина (НПР+Г).

Животные 1-й и 2-й группы на протяжении 28 суток получали рацион, включающий 14 % протеина (в виде казеина), 10 % жиров и 76 % углеводов, сбалансированный по всем нутриентам (Reeves et al., 1993). Животные 3-й группы получали изоэнергетический рацион, содержащий 4,7 % белка, 10 % жиров, 85,3 % углеводов.

После четырехнедельного содержания крыс на экспериментальной диете моделирование ацетаминофен-индуцированного гепатита осуществляли путем введения per os ацетаминофена в дозе 1 г/кг массы животных в 2 % крахмальной взвеси на протяжении 2 дней с помощью специального зонда (Voloshchuk, Kopylchuk, 2015).

Цервикальную дислокацию крыс под легким эфирным наркозом осуществляли на 31 сутки эксперимента.

Выделение лейкоцитов периферической крови осуществляли с помощью метода седиментации в градиенте плотности фиколл-верографина (ρ = 1,077 г/мл). Жизнеспособность клеток, определяемая в тесте с трипановым синим, составляла не менее 97%.

Для выделения митохондриальной фракции суспензию лейкоцитов ресуспендировали в 5 объемах буфера, содержащего 0,25 М сахарозу, 10 мМ фосфата калия, 1 мМ ЭДТА (рН 7,2). Суспензию клеток гомогенизировали. Гомогенат центрифугировали при 800 g на протяжении 10 минут. Осадок центрифугировали при 8000 g 10 минут и ресуспендировали с буфером без ЭДТА (Biswas et al., 1997). Определение NADH-убихинонредуктазной активности проводили спектрофотометрически (Marchenko, Voloshchuk, 2014). NADH-убихинонредуктазную активность расчитывали с учетом коэффициента молярной экстинкции 6,22•103 М-1•см-1. Сукцинатдегид-рогеназную активность определяли по интенсивности восстановления феррицианида калия (Sharova, Vekshin, 2004). Содержание белка определяли по Лоури.

Статистическую значимость полученных результатов биохимических анализов оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни с применением программы обработки статистических данных «Statistica 6.0».

RESULTS AND DISCUSSION

Результаты исследований показали, что в условиях ацетаминофен-индуцированного гепатита наблюдается нарушение функциональной активности энзиматических маркеров дыхательной цепи митохондрий лейкоцитов. Нами установлено торможение активности NADH-убихинонредуктазы лейкоцитов крыс с токсическим гепатитом в 1,3 раза по сравнению с показателями контрольной группы животных (рис. 1). Вероятно, причиной установленного факта является нарушение структурно-функциональной организации Комплекса І дыхательной цепи в данных экспериментальных условиях. Показано, что метаболит ацетаминофена – N-ацетил-р-бензохинонимин (NAPQI) способен связываться с остатками цистеина белков дыхательной цепи (Heard et al. , 2011). Учитывая, что структурными компонентами NADH-убихинонредуктазного комплекса являются железо-серные кластеры, возможно, одним из механизмов нарушения функциональной активности исследуемого фермента является образование комплексов

NAPQI-протеин. Сегодня образование ковалентных

комплексов

метаболитов

ацетаминофена с митохондриальными белками рассматривается как триггер первичной митохондриальной дисфункции, определяющий дисбаланс процессов энергообеспечения (Andringa et al., 2008).

В то же время у белок-дефицитных животных с токсическим гепатитом наблюдается практически десятикратное снижение активности NADH- убихинонредуктазы. Вероятно, такие изменения связаны с нарушением синтеза отдельных субъединиц NADH-убихинонредуктазного комплекса в условиях дефицита белка. Установленный факт свидетельствует, что в условиях токсического гепатита, усугубленного алиментарной белковой недостаточностью, в митохондриях лейкоцитов происходит нарушение способности транспортировать электроны в дыхательную цепь от NADH-зависимых субстратов.

Figure 1. Активность NADH-убихинонредуктазы в митохондриальной фракции лейкоцитов периферической крови в условиях ацетаминофен-индуцированного гепатита на фоне алиментарной депривации протеина

Примечание (тут и далее):

К – крысы, содержащиеся на полноценном полусинтетическом рационе

Г – крысы с ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащиеся на полноценном полусинтетическом рационе

НПР + Г – крысы с ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащиеся на низкопротеиновом рационе

*- cтатистическая значимость различий между опытной и контрольной группой (Р < 0,05)

Figure 2. Активность сукцинатдегидрогеназы в митохондриальной фракции лейкоцитов периферической крови в условиях ацетаминофен-индуцированного гепатита на фоне алиментарной депривации протеина

Поэтому на следующем этапе исследований актуальным было изучение активности сукцинатдегидрогеназы лейкоцитов периферической крови у животных с токсическим гепатитом как посредника между FAD-зависимыми субстратами и дыхательной цепью. Именно активность сукцинатдегидрогеназы в значительной степени определяет скорость использования кислорода и синтеза АТР в митохондриях в условиях нарушения активности NADH-убихинонредуктазы (Cecchini, 2003). Результаты наших исследований показали, что у животных с ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащихся в различных режимах белкового питания, происходит активация сукцинатзависимого пути окисления по сравнению с интактными животными (рис. 2). Вероятно, в условиях повышенной потребности в энергии, активация сукцинатдегидрогеназы позволяет сохранить энергосинтезирующую функцию цитохромного участка дыхательной цепи митохондрий лейкоцитов. Увеличение потока электронов через Комплекс ІІ дыхательной цепи митохондрий лейкоцитов на фоне нарушения работы Комплекса І, вероятно, отражает активацию компенсаторных метаболических потоков в условиях повышенной потребности в энергии и обеспечивает поддержание энергообеспечения лейкоцитов на уровне, достаточном для их функционирования.

Установленные закономерности работы ферментов дыхательной цепи митохондрий лейкоцитов могут быть основополагающими в обеспечении их функционирования в условиях токсического гепатита на фоне алиментарной депривации протеина.

Результаты исследований могут использоваться для биохимического обоснования терапевтических подходов к устранению и коррекции последствий нарушения энергетического обмена лейкоцитов в условиях        ацетаминофен-индуцированного гепатита, усугубленного алиментарной депривацией протеина.