Активность ферментов поджелудочной железы у цыплят-бройлеров на разных этапах пищеварения

Поджелудочная железа — один из центральных органов пищеварительной системы, который вырабатывает ферменты, гидролизующие все основные питательные вещества до мономеров, способных всасываться в кровь и лимфу. Клетки пищеварительных желез продуцируют гидролитические ферменты по общим законам синтеза белка. В настоящее время механизмы этого процесса детально изучены (1). Однако существует сроч-509

ный транспорт ферментов специализированными секреторными клетками (гландулоцитами), который представляет собой процесс их рекреции, то есть поглощения эндогенных секреторных продуктов гландулоцитами из крови и последующего выделения в неизменном виде в составе пищеварительных соков. Следовательно, экзосекреты пищеварительных желез содержат два пула ферментов — синтезированные de novo и рекретированные. В классической физиологии секреции акцентируется внимание на первом пуле и, как правило, не принимается во внимание второй (2-4). По итогам анализа энтеропанкреатической циркуляции панкреатических ферментов S.S. Rothman и соавт. (5) сделали вывод, что поджелудочная железа при известных условиях не может синтезировать больше 25-50 % от общего количества панкреатических ферментов.

Поступление пищеварительных ферментов в кровь взаимосвязано с механизмом регуляции секреции поджелудочной железы: во-первых, так поддерживается ферментный гомеостаз, во-вторых, возникает возможность рекреции ферментов из крови в качестве исходного материала для ацинарного аппарата поджелудочной железы (2). В этой связи в последние годы возрастает интерес к изучению вопросов, связанных с циркуляцией панкреатических ферментов в организме человека и животных, поскольку эти энзимы не только участвуют в пищеварении, но и обеспечивают регуляторные функции в организме (6-9). Кроме того, исследование циркуляции панкреатических ферментов в организме животных имеет важное значение для понимания дефицита ферментов в процессе пищеварения и их использования как биохимических маркеров при оценке состояния поджелудочной железы.

В научной литературе имеются данные по усвояемости аминокислот у птицы (10), морфометрическим (11) и цитологическим (12) показателям экзокринного отдела поджелудочной железы, активности ферментов в тканях поджелудочной железы (3, 13, 14). Однако панкреатические ферменты при этом изучались в опытах in vitro. Исследования пищеварения у кур в хроническом эксперименте с использованием фистульной методики за рубежом малочисленны (15, 16).

В настоящей работе мы впервые сопоставили активность панкреатических ферментов в соке поджелудочной железы, химусе 12-перстной кишки in vivo, а также в плазме крови и помете у современного кросса сельскохозяйственной птицы. Продолжая традицию русской физиологической школы академика И.П. Павлова, при изучении пищеварения использовали фистульный метод, который позволяет проанализировать регуляцию деятельности органа, не нарушая естественные физиологические и биохимические процессы, и выявлять механизм влияния различных факторов (добавок, кормов и т.д.) на уровне целостного организма. На наш взгляд, такой подход имеет наибольшее научное и практическое значение.

Цель работы — определение активности панкреатических ферментов в разных биологических средах у фистулированных цыплят-бройлеров.

Методика . Исследования проводили на мясных цыплятах кросса Cobb 500 в условиях вивария (Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства — ВНИТИП). Условия содержания и кормления бройлеров соответствовали нормам ВНИТИП. Физиологические опыты выполняли на двух группах цыплят (по 3 гол. в каждой).

В одной группе оперировали цыплят старше 20-суточного возраста для получения химуса 12-перстной кишки. При этом фистулу вживляли в 12-перстную кишку напротив места впадения в нее протоков поджелудочной железы и желчи. К исследованиям приступали через 3-5 сут, когда со-510

стояние здоровья цыплят восстанавливалось. Цыплят фиксировали в специальном станке. Первую порцию химуса собирали натощак, затем цыплята получали 30 г комбикорма, и следующий сбор осуществляли через 1 и 2 ч после кормления. Каждую порцию химуса (3-5 мл) центрифугировали, разводили раствором Рингера (1:50) и использовали для определения активности ферментов.

В другой группе изучали внешнесекреторную функцию поджелудочной железы на цыплятах-бройлерах (возраст 30 сут и старше) с хронической фистулой панкреатического протока, прооперированных по методу Ц.Ж. Батоева и С.Ц. Батоевой (17). Физиологический эксперимент продолжался 180 мин. В первые 30 мин опыта определяли количество панкреатического сока и его ферментативную активность натощак, затем давали 30 г корма. Далее панкреатический сок собирали каждые 30 мин, измеряли его количество и оценивали ферментативную активность.

Активность амилазы определяли по Смиту-Рою-Уголеву (18), протеаз — по гидролизу казеина при колориметрическом контроле (19), активность липазы — на биохимическом анализаторе Chem well 2900 (T) («Awareness Technology, Inc.», США) с использованием набора реагентов Human («HYMAH», Германия).

Кровь получали из подкрыльцовой вены после окончания физиологических опытов, добавляли гепарин, подвергали центрифугированию в течение 5 мин при 5000 об/мин и определяли активность панкреатических ферментов в плазме.

Активность ферментов в помете оценивали теми же методами в материале от цыплят, полученном после окончания физиологического опыта.

На каждом цыпленке было выполнено не менее 10 опытов.

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием t- критерия Стьюдента.

Результаты. Согласно полученным данным, наибольшее количество ферментов, участвовавших в кишечном пищеварении, производила поджелудочная железа (табл.).

Активность панкреатических ферментов в процессе пищеварения у цыплят-бройлеров кросса Cobb 500 ( M±m , физиологический опыт)

Показатель	:   А	i Б i	В	i Г i	А:Б:В:Г
Амилаза, мг/(мл•мин)	4677±832,3	1073±229,2	8±0,7	16±6,8	585:134:1:2
Липаза, E/л	3200±201,9	3950±359,7	12±3,9	50±12,5	267:329:1:4
Протеазы, мг/(мл•мин)	215±37,9	40±7,3	0,4±0,10	4±0,6	537:100:1:10
Амилаза/протеазы	22:1	27:1	20:1	4:1

П р и м е ч а н и е. А — панкреатический сок, Б — химус 12-персной кишки, В — плазма крови, Г — по- мет. При вычислении соотношения активности в разных средах за 1 принимали показатель в сыворотке крови, при сравнении амилолитической и протеолитической активности — показатель по протеазам.

С экскрементами из организма выделялось относительно малое количество активных панкреатических ферментов. Так, в помете активность амилазы уменьшалась в 67 раз, липазы — в 79 раз, протеаз — в 10 раз по сравнению с 12-перстной кишкой. Эти данные подтверждают рекрецию ферментов, один из способов которой — возврат панкреатических энзимов через кишечник в кровь. Процесс аналогичен реабсорбции в почках, когда из первичной мочи необходимые организму питательные и минеральные вещества возвращаются в кровь. Однако панкреатические ферменты поступали в кровь неравномерно: относительно химуса 12-перстной кишки наименьшая активность отмечалась в крови у липазы, средняя — у амилазы, относительно высокая — у протеаз. По-видимому, это было связано со строением молекул ферментов (20-22). Об относительно большем выделении протеаз с пометом свидетельствовало и самое низкое амилазно-протеазное соотношение в помете (см. табл.).

Обсуждая полученные результаты, следует иметь в виду, что использованная нами методика наложения фистулы панкреатического протока не имеет аналогов в мире и позволяет получать панкреатический сок только в период физиологических опытов, а в остальное время направлять его по внешнему анастомозу в кишечник, что минимизирует последствия фистулирования и дает возможность изучать внешнесекреторную функцию поджелудочной железы продолжительное время на здоровой птице.

По сообщениям S.S. Rothman и соавт. (5), из тонкой кишки человека активно всасывается 50-65 % и более меченых и немеченых амилазы и химотрипсина, по данным H.C. Heinrich и соавт. (23) — 50-70 % трипсина. Согласно наблюдениям А.А. Алиева (24), из тонкой кишки в оттекающую от нее лимфу всасываются липаза, амилаза и мальтаза.

Что касается панкреатических ферментов в плазме крови, то ами- лаза и липаза находились в активном состоянии, а протеазы связывались с ингибиторами трипсина и не проявляли ферментативной активности (2, 20-22). Соотношение амилазы и протеаз в панкреатическом соке и плазме крови имели близкие значения, что можно использовать при диагностике состояния поджелудочной железы.

Существенные различия наблюдались в активности ферментов в панкреатическом соке и химусе 12-персной кишки. При выделении пан- креатического сока в кишку активность амилазы и протеаз снижалась примерно в 5 раз (см. табл.). Однако активность липазы в кишечнике была на уровне активности фермента в секрете поджелудочной железы (Р > 0,05). Это можно объяснить стимулирующим влиянием желчи, которая выделялась в кишечник одновременно с панкреатическим соком. Амилазно-протеазное соотношение увеличивалось в химусе кишечника по сравнению с панкреатическим соком, что могло быть связано с наличием дополнительных амилолитических ферментов слюны и кишечного сока.

Рис. 1. Активность ферментов в панкреатическом соке после приема корма у цыплят кросса Cobb 500: 1 — амилаза, х 10 мг/(мл • мин); 2 — протеазы, мг/(мл • мин); 3 — липаза, х 50 Е/л (физиологический опыт).

Через 1 ч после приема корма активность амилазы панкреатического сока увеличивалась почти в 2 раза и сохранялась такой до конца опыта (рис. 1). Активность протеаз достигала максимальных значений через 1,5 ч после приема корма, увеличиваясь в 1,3 раза, затем этот показатель несколько снижался и вновь увеличивался до максимума в период, соответствующий нейрохимической фазе регуляции панкреатической секреции. Активность липазы увеличивалась постепенно, достигая максимальной отметки к концу опыта, когда она в 2,0 раза пре- вышала исходные значения (до кормления).

После приема корма кривые ферментативной активности резко устремлялись вверх (см. рис. 1). Такая реакция обусловлена сложнорефлекторной регуляцией панкреатической секреции. В этом случае на внешнесекреторную функцию железы оказывали влияние как условные сигналы (постановка в станок для опыта и т.д.), так и безусловные рефлексы (2528). Рефлекторная дуга последних начиналась с рецепторов в ротовой по-

Рис. 2. Ферментативная активность химуса 12-перстной кишки у цыплят кросса Cobb 500 до кормления (1) , через 1 ч (2) и 2 ч после кормления (3) : а — амилаза, мг/(мл•мин); б — протеазы, х 0,1 мг/(мл^мин); в — липаза, х 50 Е/л (физиологический опыт).

Динамика ферментативной активности химуса и секрета поджелудочной железы несколько различалась (рис. 2). Наиболее интенсивно (в 1,7 раза) после приема корма увеличивалась амилолитическая активность. Активность липазы повышалась с 3450±370,2 до 4050±420,5 Е/л через 2 ч после приема корма. Протеолитическая активность химуса существенно не изменялась — с 51±17,9 до 35±10,2 мг/(мл•мин) к концу опыта.

Таким образом, у цыплят-бройлеров панкреатические ферменты из поджелудочной железы направляются в 12-перстную кишку, участвуя в гидролизе питательных веществ корма, а затем поступают в кровь. Незначительная часть активных ферментов удаляется из организма с пометом. Кормление служит мощным стимулом панкреатической секреции. Период сложнорефлекторной фазы регуляции поджелудочной железы у цыплят-бройлеров длится 120 мин с момента кормления. Динамика активности ферментов после приема корма в кишечнике аналогична динамике их активности в панкреатическом соке, хотя колебания дуоденальной активности амилазы, липазы и протеаз выражены не так значительно. Наиболее близкое амилазно-протеазное соотношение ферментов наблюдается в панкреатическом соке и плазме крови, что может быть использовано при диагностике состояния поджелудочной железы.