Активность гваякол-зависимой пероксидазы в листьях Plantago major L

Впервые была изучена активность гваякол-зависимых пероксидаз при разных значениях рН в листовых пластинках Plantago major L.

Оптимум рН катализируемой реакции – важная характеристика ферментов. В частности, пероксидазе, выделенной из томатов, свойственен оптимум рН равный 6,6 (Signoret, Crouzet, 1978), из полыни – 5,2 (Садвакасова, 1981). Пероксидаза хрена имеет несколько оптимумов – при рН 4,5 (Maehly, 1955) и 7,0 (Gaspar et al., 1977), что обусловлено наличием нескольких молекулярных форм фермента, проявляющих максимальную активность в более узких пределах рН (Газарян и др., 1998). Более того, в зависимости от рН среды фермент может катализировать разные реакции. Так, пероксидаза красной водоросли при рН 6,7 катализирует реакцию гидроксилирования фенолов, а при рН 5,4 – реакцию их бромирования в присутствии NaBr (Андреева, 1988). Максимальная активность пероксидазы перикарпа китайской сливы наблюдается при рН 6,5 и 70°С, а полифенолоксидазы – при рН 6,5 – 6,75 и 20°С (Mizobutsi et al., 2010). Кроме того, у растений с наступлением осени в период с июля по сентябрь может наблюдаться увеличение активности этого фермента (Zolfaghari et al., 2010). Вероятно, это связано с тем, что устойчивость растительных тканей к различным стрессовым воздействиям определяется в немалой степени активностью ферментов, обладающих пероксидазной активностью (Долгова, 2004; Янчевская и др., 2006; Ершова, 2007; Жуйкова и др., 2009; Алиева и др., 2010; Müftlügil, 1985; Thongsook, Barrett, 2005). В то же время, не смотря на интерес к этому ферменту, пероксидаза у многих растительных видов изучена не достаточно.

В этой связи целью наших исследований было проследить изменения в активности гваякол-зависимой пероксидазы подорожника большого в течение июня, июля и августа при значениях рН 4,6, 5,4 и 6,2 в двух различных точках ареала вида – г. Иркутске и на юговосточном побережье Байкала в районе устья речки Выдриная.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материал для исследования. Исследовались листья подорожника большого Plantago major L., собранного в течение вегетационного периода 2009 года на территории стационара «Речка Выдринная» и в г. Иркутске.

Выделение слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы. Для выделения пероксидаз слабосвязанных с клеточной стенкой, навеску (1 г) ткани листьев помещали в шприц с 5 мл холодного цитратно-фосфатного буфера (рН 5,5) и выдерживали при разреженном давлении 2–3 раза по 1 мин (Граскова и др., 2004). Полученный раствор центрифугировали 15 мин при 3 тыс. об./мин, отделяя от частиц ткани, и супернатант использовали для дальнейшего определения активности фермента.

Выделение растворимой пероксидазы. Навеску ткани после экстракции слабосвязанных пероксидаз помещали в 5 мл холодного цитратно-фосфатного буфера и растирали в фарфоровой ступке при 4 °С (Паду, 1995) для выделения растворимых пероксидаз Полученный гомогенат центрифугировали при 3 тыс. об./мин в течение 15 мин. Супернатант использовали для определения активности фермента.

Определение пероксидазной активности. Активность пероксидаз в листьях растений определяли по изменению оптической плотности (длина волны 580 нм) в реакционной смеси следующего состава: 0,5 мл 0,1 М цитратно-фосфатного буфера (рН от 4,6 до 6,2 с шагом 0,8), 0,5 мл 0,3 % перекиси водорода («Реахим», Россия), 0,5 мл 0,05 % гваякол (Sigma, США) и 0,5 мл пробы (1г пробы растирали в 10 мл Цитратно-фосфатного буфера рН 5,5).

Активность пероксидазы определяли при 25 °С сразу после выделения ферментов из образцов. Активность фермента рассчитывали по методу Бояркина (Бояркин, 1951) и выражали в условных единицах на мг сырого веса тканей по формуле: А = ∑ (α β γ)/d t, где ∑ - экстинция (0,125), α – отношение количества буфера, взятого для приготовления вытяжки в мл к весу сырой ткани, β – степень дополнительного разведения вытяжки в реакционной смеси, γ – степень постоянного разведения вытяжки в реакционной смеси, d – толщина поглощающего слоя кюветы, t – время реакции.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В точке отбора проб на берегу озера Байкал активность слабосвязанной пероксидазы у подорожника большого была высокой в июне, заметно снижалась к июлю, но начинала возрастать в августе, причем главным образом за счет активности при рН 5,4 и 6,2 (рис. 1).

Для растворимой фракции гваякол-зависимой пероксидазы картина была обратная (рис. 2). Минимум активности при всех вариантах рН наблюдался в июне, а максимум – в июле.

Сходные данные были получены и по активности пероксидазы в июле и августе для г.

Иркутск (рис. 3, 4). В июле активность слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы не зависела от рН в обоих точках сбора и составляла порядка 0,02 у.е./мг. В отличие от Байкала, в городе Иркутск повышение активности слабосвязанной с клеточной стенкой гваякол-зависимой пероксидазы в августе происходило за счет повышения ее активности при рН 6,2.

Рисунок 1 Активность слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы листьев Plantago major в июне, июле и августе, Байкал

Рисунок 2 Активность растворимой пероксидазы листьев Plantago major в июне, июле и августе, Байкал

Рисунок 3 Активность слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы листьев Plantago major в июле и августе, Иркутск

Рисунок 4 Активность растворимой пероксидазы листьев Plantago major в июле и августе Иркутск

Активность растворимой пероксидазы, не смотря на схожесть динамики, была выше на Байкале, чем в Иркутске, за исключением рН 6,2, когда данные по обоим географическим точкам совпали и составили 0,5 у.е./мг для июля и 0,2 для августа. Максимальные значения активности растворимой пероксидазы для Иркутска наблюдались при этой рН (6,2), а на побережье Байкала активность была максимальна при рН 5,4 и в июле, и в августе.

На основании полученных данных можно предполагать следующее: не смотря на то, что растворимая пероксидаза обычно доминирует в растительных тканях, адаптация к осенним сезонным изменениям у одуванчика связана главным образом с увеличением активности слабосвязанной пероксидазы как более подвижной фракции этого фермента. В то же время, влияние города Иркутск выражалось в уменьшении активности не слабосвязанной, а растворимой гваякол-зависимой пероксидазы подорожника при всех значениях рН как в июле, так и в августе по сравнению с побережьем Байкала.