Активность энтомопатогенных штаммов-продуцентов Bacillus thuringiensis var. israelensis при разных методах хранения

Защита сельскохозяйственных растений, включая овощные, зерновые и плодовые культуры, от насекомых-вредителей представляет серьезную экономическую проблему. Ежегодные потери сельского хозяйства достигают несколько миллиардов рублей (1). Для получения экологически чистой продукции используются биологические препараты, изготовленные на основе микроорганизмов различного происхождения: бактерий, виру-

Работа поддержана проектом прикладных научных исследований и экспериментальных разработок (ПНИЭР) по лоту шифр 2017-14-579-0030 по теме: «Создание микробиологических препаратов для расширения адаптационного потенциала сельскохозяйственных культур по питанию, устойчивости к стрессам и фитопатогенам» (шифр заявки 2017-14-579-0030-013), соглашение ¹ 14.607.21.0178, уникальный идентификатор работ (проекта) RFMEFI60717X0178.

сов, актиномицетов (1, 2), энтомофторовых грибов и энтомопатогенных нематод (3, 4). Однако в мировой практике защиты растений от вредных насекомых приоритетное место отводится энтомопатогенным бактериям Bacillus thuringiensis (Bt) (5-7). Они с успехом используются в качестве безопасного энтомоцидного и ростстимулирующего средства (8, 9). За последние годы число разновидностей B. thuringiensis , выделенных отечественными и зарубежными исследователями, многократно увеличилось — в настоящее время их идентифицировано более 70 (10). Бациллы группы thuringiensis образуют споры, кристаллический эндотоксин (11-13), термостабильный экзотоксин (14), а некоторые — энзимы с антифунгальными свойствами (15). К преимуществам бактерий Bt можно отнести технологичность, широкий спектр действия (16-18), безопасность для человека и окружающей среды (19, 20), нецелевых насекомых (21-23). Рентабельное производство экологически безопасных биологических препаратов на основе B. thuringiensis нуждается в постоянном снабжении штаммами-продуцентами с высокой технологичностью и вирулентностью, что требует создания их коллекций и подбора оптимальных сроков и методов хранения.

Традиционно бактериальные культуры хранятся при периодическом пересеве на свежие среды. При использовании этого метода должны быть соблюдены три основных условия: подходящая поддерживающаяся среда, идеальная температура хранения, необходимая частота пересевов (24, 25). Коллекции культур Bt сохраняются на скошенном мясопептонном агаре (МПА), рыбном агаре (РА) при температуре 3-5 °С в пробирках с незапа-рафинированными и запарафинированными ватно-марлевыми пробками, под минеральным маслом, в трупах насекомых, в кристаллах NaCl, в лио-фильно высушенном состоянии и методом криоконсервации.

Бактокулицид — высокоэффективный экологически чистый биопрепарат на основе BtH14 для подавления численности кровососущих комаров и мошек (разработан во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии, г. Санкт-Петербург), который испытан в различных эколого-географических зонах от северных регионов до тропического пояса (Россия, Беларусь, Украина, Франция, Чехословакия, Куба, Индия, Шри-Ланка). По активности он не уступает, а в ряде случаев превосходит зарубежные аналоги (26).

Мы изучили сохранность технологически значимых свойств у штаммов BtH14, используемых в производстве бактокулицида, при разных методах хранения. В настоящей работе для этого впервые применили криоконсервацию, а при хранении в лиофильно высушенном состоянии в качестве защитной среды использовали 20 % NaCl.

Цель исследования — оценить жизнеспособность, продуктивность и ларвицидность у набора штаммов Bacillus thuringiensis var. israelensis (BtH₁₄) при хранении различными методами в течение разного времени.

Методика. Штамм BtH₁₄ 266/2 поступил из коллекции ССЕВ (Culture Collection of Entomogens Bacteria, г. Прага, Чехословакия). Штаммы 87, 404, 19/43, 7-1/23, 71/82 были выделены из природных субстратов (вода, ил, почва), штаммы 71, 87а, 19/1 получили методом селекции. Изучали активность штаммов BtH₁₄ при различных методах и сроках хранения: 266/2 — на мясопептонном агаре (МПА) и в трупах комаров Culex pipiens molestus 1 год, в кристаллах NaCl 1,5 года; 71 — на МПА 1 год без пересева, 2 года с пересевом через 6 мес; 87а — методом криоконсервации 10 лет; 87, 404, 19/43 — в лиофильно высушенном состоянии 28 лет; 7-1/23, 71/82, 19/1 — в кристаллах NaCl 27 лет.

Культуру BtH14 выращивали на плотных питательных средах МПА или РА при температуре 29±1 °С до полного образования спор и кристаллов. При изучении морфологических типов колоний культуру рассевали на РА методом истощающегося мазка. Микроскопию выполняли с использованием черного анилинового красителя (26) на 7-е сут. Продуктивность штаммов определяли на дрожже-полисахаридных средах при выращивании глубинным способом в колбах Эрленмейера на качалке с аэрацией (220 об/мин) в течение 72 ч при 28 °С. Титр клеток учитывали общепринятым методом серийных разведений с высевом на РА.

Ларвицидную активность изолятов оценивали по методике, предложенной Всемирной организацией здравоохранения (10, 28), на личинках комаров Aedes aegypti 4-го возраста инсектарной популяции. Готовили суспензию культуральной жидкости (КЖ) методом разведений в водопроводной воде в 200, 400, 800 и 1600 тыс. раз, что соответствовало условному содержанию КЖ 0,5x10 — 3 ; 0,25x10 — 3 ; 0,125x10 — 3 ; 0,0625x10 — 3 %, или 5,0; 2,5; 1,25; 0,625 мкл КЖ/л. В чашки Петри наливали по 50 мл суспензии в соответствующем разведении и помещали по 25 личинок комаров. Чашки ставили в термостат на 24 ч при 28-30 °С, после чего учитывали гибель личинок. Смертность для каждой концентрации с поправкой на гибель в контроле вычисляли по формуле Х = ( M o - M к )/(100 - М к ) x 100 %, где М _о и М _к — средние арифметические значения числа мертвых особей соответственно в опыте и контроле. На основании полученных данных рассчитывали ЛК₅₀, выраженную в процентах гибели личинок по формуле Кербера (29): lg ЛК₅₀ = lg C M - a ( £ X₂ - 0,5), где С М — максимальная апробируемая концентрация препарата, σ — логарифм отношения для каждого предыдущего разведения к последующему (логарифм кратности разведений), ∑ Х₂ — сумма отношений числа погибших насекомых к общему числу подвергшихся действию для соответствующего разведения.

Лиофилизацию штаммов 87, 404, 19/43 выполняли в 1988 году по следующей схеме. На скошенном МПА выращивали культуру в течение 7 сут, биомассу смывали 5 мл 20 % NaCl, получали бактериальную суспензию с титром 107-108 КОЕ/мл. Пастеровской пипеткой вносили по 0,5 мл суспензии в стеклянные ампулы, закрывали стерильным ватным тампоном, затем ватной пробкой. Интервал между внесением суспензии в ампулу и процессом лиофилизации сводили до минимума (не более 1 ч). Замораживали культуру в холодной ванне при температуре -22 °С в течение 1 ч, высушивали при -45 °С в течение 23 ч, предварительно удалив ватные пробки из ампулы. Ампулы запаивали вод вакуумом над газовой горелкой и хранили в холодильнике при 3-5 °С.

При хранении BtH14 в кристаллах NaCl культуру выращивали на МПА при температуре 30 °С в течение 5-7 сут до полного образования спор и кристаллов эндотоксина. В пробирку с культурой вносили 5 мл физиологического раствора, затем петлей тщательно растирали биоматериал до получения гомогенной взвеси и вносили по 0,5 мл в биологические пробирки, которые закрывали обычными ватно-марлевыми пробками и хранили при 18-22 °С. Повторность каждого варианта 20-кратная. Используя метод криоконсервации, культуру в стационарной фазе роста замораживали в 10 % глицерине и размещали в Станции низкотемператуного автоматизированного хранения биологических образцов («Liconic Instruments», Лихтенштейн) при 80 °С (28). Для контроля культуры BtH14 на жизнеспособность после замораживания и оценки исходных значений продуктивности и ларвицидной активности одну из повторностей размораживали при 37 °С в течение 3 мин и пересевали на РА для дальнейших манипуляций.

Полученные данные обрабатывали методом дисперсионного анали- за (29) при доверительном интервале 95 %. В таблицах представлены средние (M) и стандартные ошибки средних (±SEM).

Результаты. В морфологическом составе популяции штамма BtH₁₄ 266/2, хранившегося тремя методами, происходили изменения (табл. 1). При рассеве на МПА были выявлены колонии четырех морфотипов: I-RS форма — колонии серовато-белого цвета со слегка розовым оттенком, округленные или неправильно округлой формы, плоские, с мелко-шероховатой поверхностью; через 5 сут образовывали споры и кристаллы эндотоксина. II-RS форма (пигментированная) — колонии окрашены в сиренево-розовый цвет; пигмент в среду не выделялся. III-R форма — колонии матово-белые, сухие, морщинистые, плоские, округлые; на агаризован-ных средах процесс споро- и кристаллообразования завершался через 3 сут. IV-S форма — колонии кремово-бежевого цвета с лопастно-изрезанными краями; в 6-суточной культуре на МПА встречались только вегетативные клетки в цепочках, часто деформированные. Соотношение колоний различных морфологических типов менялось в зависимости от способа хранения культуры. Типичные для популяции фенотипы I-RS формы составляли от 70,4 до 98,6 %, морфологически измененные — от 0,1 до 28,8 % (см. табл. 1). Наибольшую изменчивость наблюдали при хранении штамма в трупах личинок комара C. pipiens molestus. При рассеве культуры, кроме основного I-RS морфотипа, выявили 28,8 % и 0,8 % колоний соответственно III-R и IV-S морфотипов.

1. Характеристика естественной изменчивости штамма BtH₁₄ 266/2 в зависимости от метода хранения (лабораторный опыт)

Метод и срок хранения	Просмотрено колоний, шт.	Доля колоний по морфотипу, %
		I-RS	II-RS (пигментированный) у	III-R	IV-S
На МПА, 1 год	1147	98,3	0,1		1,6
В кристаллах NaCl, 1,5 года	654	98,6		1,4
В трупах личинок Culex pipiens
molestus , 1 год	974	70,4		28,8	0,8

П р и м еч а ни е. МПА — мясопептонный агар. Прочерки означают отсутствие колоний соответствующего морфологического типа. Описание морфотипов см. в разделе «Результаты».

2. Биологическая активность различных морфотипов штамма BtH₁₄ 266/2 в зависимости от метода хранения ( M ±SEM, лабораторный опыт)

Морфотип	Метод хранения	Титр спор, ½109/мл	ЛК 50 для L4 комара Aedes aegypti , ½10-3 %
I-RS	На МПА (мясопептонный агар)	2,55±0,10	0,21±0,04
II-RS (пигментированный)		2,43±0,11	0,32±0,04
IV-S		1,23±0,12	0
I-RS	В кристаллах NaCl	3,23±0,11	0,19±0,04
III-R		2,20±0,12	0,26±0,04
I-RS	В трупах личинок Culex pipiens	2,28±0,09	0,24±0,04
II-R	molestus	1,21±0,12	0,38±0,04
IV-S		0,98±0,10	0

П р и м еч а ни е. Описание морфологических типов колоний см. в разделе «Результаты».

У разных морфологических вариантов изучили продуктивность при культивировании в жидкой питательной среде и ларвицидность для комара A. aegypti (табл. 2). Колонии I и II морфотипов в культуре, хранившейся на МПА, имели практически равную продуктивность: их титры достигали соответственно (2,55±0,10)½109 и (2,43±0,11)½109 КОЕ/мл культуральной жидкости. По ларвицидной активности, составившей (0,21±0,04)½10-3 и (0,32±0,04)½10-3 %, I морфотип превосходил II морфотип в 1,5 раза. Культура VI морфотипа медленно росла без образования спор и кристаллического эндотоксина и была непатогенной для личинок A. aegypti. Лучшие результаты показал метод хранения BtH14 в кристаллах NaCl. Хуже всего штамм хранился в трупах личинок комаров. Штамм 266/2 не обладал стабильностью и при хранении диссоциировал с образованием вариантов с пониженной продуктивностью, причем гладкие S-варианты полностью утратили вирулентность. Селекционная работа позволила выделить более стабильный штамм BtH14 71, на основе которого был разработан способ получения ларвицидного препарата.

В таблице 3 представлены титры и активность штаммов BtH14 при разных методах хранения.

3. Биологическая характеристика штаммов BtH₁₄ после длительного хранения ( M ± m , лабораторный опыт)

Штамм	Метод и срок хранения	Титр спор, ½109/мл		ЛК 50 для L4 комара Aedes aegypti , ½10 - 3 %
		исходное значение	после хранения	исходное значение	после хранения
71	На МПА, 1 год без пересева	2,29±0,10	2,83±0,11	0,18±0,02	0,19±0,02
	На МПА, 2 года с пересевом каждые 6 мес		2,19±0,10		0,21±0,02
87а	Криоконсервация:
	сразу после замораживания	2,74±0,12		0,178±0,02
	через 3 года		2,78±0,11		0,18±0,02
	через 6 лет		2,82±0,10		0,19±0,02
	через 10 лет		2,73±0,10		0,19±0,02
87	Лиофилизация, 28 лет	4,45±0,14	3,68±0,12	0,087±0,02	0,11±0,02
404	Лиофилизация, 28 лет	4,34±0,12	3,42±0,10	0,092±0,02	0,12±0,02
19/43	Лиофилизация, 28 лет	3,86±0,11	3,32±0,12	0,103±0,02	0,14±0,02
7-1/23	В кристаллах NaCl, 27 лет	4,29±0,11	3,52±0,12	0,10±0,02	0,135±0,02
71/82	В кристаллах NaCl, 27 лет	4,18±0,14	3,28±0,13	0,11±0,02	0,142±0,02
19/1	В кристаллах NaCl, 27 лет	3,98±0,12	3,12±0,12	0,108±0,02	0,15±0,02
П р и м е ч а н и е. МПА — мясопептонный агар.

Сравнение титров и ларвицидной активности у разных штаммов BtH14 в зависимости от метода хранения подтвердило (табл. 3), что у штамма 71 через 1 год хранения на МПА с запарафинированными пробками свойства практически сохранялись. При пересеве через каждые 6 мес эти показания снизились соответственно на 12 и 16 % через 1 год и на 25 и 27 % — через 2 года. Криоконсервация штамма 87а обеспечивала его высокую технологичность и ларвицидность через 10 лет хранения. Штаммы 7-1/23, 71/82, 19/1 после хранения в течение 27 лет в кристаллах NaCl имели высокие значения титра и ларвицидной активности. Не уступали им и штаммы 87, 404, 19/43, которые хранились 28 лет в ампулах в лио-фильно высушенном состоянии. Рассев штаммов BtH14 на РА методом истощающего мазка не выявил существенной изменчивости после длительного хранения в случае лиофилизации и криоконсервации.

Появление атипичных форм при хранении вполне закономерно. На основании полученных данных по предпочтительности хранения BtH14 с помощью криоконсервации, лиофилизации или в кристаллах NaCl не следует рассматривать как основание для противопоставления разных методов, которые следует использовать в дополнение друг к другу, осуществляя анализы культуры на жизнеспособность и чистоту, оценивая ее продуктивность и выполняя биотестирования перед сезоном наработки бактериального ларвицидного препарата (1).

Отметим, что коллекция штаммов Bt постоянно пополняется. Штаммы, выделенные из природных субстратов, первоначально оцениваются на энтомоцидность и продуктивность. Отобранные активные штаммы после многоступенчатой селекции депонируются и размещаются в Станции низкотемпературного автоматизированного хранения биологических образцов, в которой обеспечивается не только долгосрочное сохранение культур микроорганизмов без потерь их полезных свойств, но и надежная маркировка образцов, регистрация и отслеживание судьбы единиц хранения. База данных Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (RCAM) (Russian Collection of Agricultural Microorganisms) доступна online (http://62.152.67.70/cryobank/. RCAM поддерживает около 40 штаммов Bacillus thuringiensis различных серотипов (в зависимости от действия на насекомых-вредителей сельскохозяйственных культур): var. thuringiensis (BtH1), var. darmstadiensis (BtH10), var. israelensis (BtH14), var. kurstaki (BtH3a3b) (30).

Таким образом, штаммы Bacillus thuringiensis BtH₁₄ можно эффективно хранить методами криоконсервации, лиофилизации и в кристаллах NaCl, осуществляя анализ коммерческих продуцентов с энтомо-ларвицид-ным действием на жизнеспособность, чистоту, продуктивность и активность перед каждым сезоном наработки бактериального ларвицидного препарата на биофабриках и в биолабораториях. Более ранние исследования показали возможность хранения этими же методами культур B. thur-ingiensis других серотипов.