Активность канонической wnt сигнальной системы в артикулярных хондроцитах гиалинового хряща в процессе формирования синовиального сустава

Генетичес^ие исследования ^становили, что Wnt си^нальная система и^рает важн^ю роль в ре^^ляции развития с^елетной т^ани [6]. Тр^бчатые ^ости ^онеч-ностей челове^а и животных формир^ются в процессе вторично^о (непрямо^о) остео^енеза [15]. Мно^очис-ленными исследованиями ^становлено, что ^анони-чес^ая и не^аноничес^ая Wnt си^нальные системы ^частв^ют в ре^^ляции эндохондрально^о и перихон-дрально^о о^остенения [26, 9, 14]. В отличие от хорошо из^ченных механизмов формирования ^остной т^ани, механизмы развития синовиальных с^ставов (с^ставы, соединяющие ^остные элементы ^онечно-стей) из^чены недостаточно. Развитие с^става начинается с формирования промеж^точной зоны (interzone), разделяющей ^омо^енн^ю (непрерывн^ю) ^онденсацию мезенхимы на месте б^д^ще^о с^ста-ва, и образования трехслойной промеж^точной зоны [16]. Клет^и мезенхимы, расположенные в промеж^-точной зоне, в ходе дальнейшей дифференциров^и приводят ^ образованию различных ^леточных стр^^-т^р с^става (с^ставные связ^и, ^иалиновый хрящ и др.), в то время ^а^ ^лет^и мезенхимы, прилежащие ^ про-меж^точной зоне, в дальнейшем ^частв^ют в формировании зоны роста тр^бчатых ^остей и ^остной т^ани [22]. Имеющиеся на настоящее время данные свидетельств^ют о возможной роли Wnt в формировании синовиальных с^ставов и в ре^^ляции диффе-ренциров^и мезенхимы промеж^точной зоны [13]. Пос^оль^^ была по^азана э^спрессия Wnt4, Wnt9A, Wnt11, Wnt16 в месте формирования с^ставов [24], это позволяет предположить роль ^аноничес^ой Wnt си^нальной системы (^WntCC) в ре^^ляции развития стр^^т^р с^ставов и в ре^енерации их т^аней, измененных в рез^льтате старения или болезни [25]. Отметим, что в последние ^оды все более широ^ое распространение пол^чает заместительная ^леточная терапия (stem cell therapy) та^их распространенных заболеваний с^ставов, ^а^ остеоартрит и ревматоидный артрит [23], что делает проблем^ из^чения роли Wnt в развитии стр^^т^р с^ставов высо^о а^т^альной.

Се^одня известны три си^нальных системы, а^ти-вир^емых Wnt си^нальными моле^^лами: Wnt/Ca2+ система, Wnt/PCP (planar cell polarity) и β-^атенин зависимая ^WntCC системы. Основная роль ^WntCC системы за^лючается в ре^^ляции ^ровня свободно^о вн^т-ри^леточно^о β-^атенина, ^оторый, в свою очередь, ре^^лир^ет э^спрессию Wnt-зависимых ^енов [12]. В отс^тствии Wnt си^нала, свободный цитоплазменный в-катенин связывается комплексом GSK3a/APC/Axin, фосфорилир^ется и, в послед^ющем, разр^шается под воздействием протеаз. А^тивация ^WntCC предотвращает фосфорилирование и де^радацию β-^ате-нина, что приводит ^ повышению ^ровня свободно^о β-^атенина в цитоплазме, е^о трансло^ации в ядро ^лет^и, с послед^ющей а^тивацией транс^рипции Wnt-зависимых ^енов.

В исследованиях на первичной ^^льт^ре хондроцитов было ^становлено, что Wnt9A, э^спрессия ^ото-ро^о по^азана в т^анях с^става, а^тивир^ет ^WntCC в хондроцитах [25]. Генетичес^ие исследования на мышах, но^а^тированных по Wnt4 и Wnt9A (Wnt4-/-;Wnt9A-/-) ^становили ^ооперативное взаимодействие межд^ Wnt4 и Wnt9A в ре^^ляции развития с^ставов и поддержании их целостности [25]. Это позволило предположить, что Wnt4 и Wnt9A действ^ют через ^WntСС, направляя дифференциров^^ хондроцитов в зоне с^става. Одна^о последние работы ^бедитель-но по^азали, что Wnt4 ре^^лир^ет вн^три^леточн^ю ло^ализацию β-^атенина, вызывая передисло^ацию свободно^о β-^атенина ^ ^леточной мембране, тем самым предотвращая е^о трансло^ацию в ядро ^ле-то^ и ин^ибир^я а^тивацию ^WntСС [8]. В дополнении ^ этом^, Wnt11, э^спрессир^емый в т^анях с^ставов, взаимодейств^я с Lrp6 (^о-рецептор ^WntСС), ре^^ли-р^ет ^ровень Axin в цитоплазме ^лет^и [17]. Axin – ре^^лятор ^WntСС, о^раничивает ^ровень свободно-^о β-^атенина, ^величивая е^о фосфорилирование и протеолиз, и, та^им образом, снижает а^тивность ^WntСС [17].

В работе из^чена а^тивность ^WntСС в стр^^т^рах синовиальных с^ставов в процессе эмбрионально^о (E11 – E18), постнатально^о развития (P3 -P28) и ^ взрослых мышей. Использ^я линию TOPgal (Wnt-репортер) мышей для обнар^жения а^тивности ^WntСС в т^анях [10] и anti-doublecortin (DCX) антитела в ^а-честве специфичес^ой мет^и для арти^^лярных хондроцитов [27], мы ^бедительно продемонстрировали, что а^тивность ^WntСС ре^^лир^ется в арти^^ляр-ных хондроцитах во время эмбрионально^о и пост-натально^о развития. По^азано, что ^WntСС неа^тивна в мезенхиме промеж^точной зоны формир^юще^о-ся с^става на ранних стадиях эмбрионально^о развития (Е10 – Е14); а^тивна в дифференцир^ющихся ар-ти^^лярных хондроцитых на поздних стадиях эмбри-онально^о развития (Е16 – Е18) и в течение постна-тально^о развития (Р7 – Р10), и снова неа^тивна в арти^^лярных хондроцитах взрослых животных.

Материалы и методы. Для имм^но^истохими-чес^ой оцен^и э^спрессии lacZ, DCX и Vinculin ^риос-татные срезы (10-12 m), пол^ченные ^ TOPgal мышей на разных стадиях развития (Е14.5, Е18.5, Р7, Р10 и врослых 6-месячных животных), использовали сле-д^ющие первичные антитела: 1) ^роличьи антитела ^ а-галокгозидазе (lacZ) (1:1000, Cappel, MP Biomedicals, Solon, Ohio, USA), 2) мышиные антитела ^ Vinculin (1:100, Santa Cruse Biotechnology, CA, USA), 3) антитела из морс^ой свин^и ^ Doublecortin (DCX) (1:100, Abcam). Вторичные антитела разводили в 1% сыво-рот^е в 0.9% NaCl; во всех сл^чаях вторичные антитела использовали в разведении 1:1000. Были использованы след^ющие вторичные антитела: 1) Alexa Fluor 488 goat anti-mouse, 2) Alexa Fluor 594 goat antimouse, 3) Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit, 4) Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit. Все вторичные антитела производства Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Для о^-рас^и ядер ^лето^ использовался DAPI (1?g/ml).

Рез^льтаты ИГХ оценивались на ми^рос^опе Zeiss Axiophot 2, обор^дованном ^амерой AxioCam (Carl Zeiss, Inc., USA). Для пол^чения ^онфо^альных фото-^рафий использовался ^онфо^альный ми^рос^оп Nikon Eclipse C1 (Nikon, USA). Пол^ченные цифровые фото^рафии обрабатывались в про^рамме Adobe Photoshop.

Для о^рас^и Xgal образцы т^ани и целые эмбрионы фи^сировали в 1% ^лютеральде^иде и о^рашива-ли в течение 12-24 часов в растворе с^бстрата, со-стояще^о из 1 м^/мл 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (Xgal), 5 мM K4Fe(CN)6, 5 мМ K3Fe(CN)6 и 5 мМ MgCl2. После о^рас^и эмбрионы и образцы т^аней помещали в 3% а^ароз^ и нарезали с толщиной 60-100 ?м на вибротоме (Leica VT1000S, Leica Microsystems, Germany).

Для in situ ^ибридизации образцы т^аней фи^си-ровали в течение 12-16 часов в 4% параформальде-^иде, нарезали с толщиной 100 ?m на вибротоме Leica VT1000S и хранили при -20^оС в 100% метаноле. In situ ^ибридизацию выполняли по методи^е, описанной ранее [20].

Рез^льтаты и их обс^ждение. Для из^чения а^тивации ^WntСС в т^анях с^става была использова- на линия TOPgal мышей, в ^еном ^оторых введен ^ен а-галактозидазы (lacZ) под управлением LEF/TCF b-^атенин возб^димо^о промотера [10]. Та^им образом, ^ TOPgal мышей э^спрессия lacZ прямо связана с а^-тивацией ^WntСС и наличием свободно^о b-^атенина в ^лет^ах. Э^спрессия lacZ в т^анях может быть обна-р^жена о^рас^ой с Xgal [10] или методом им^нно^ис-тохимии (ИГХ) с помощью специфичес^их антител ^ lacZ. TOPgal мыши с высо^им ^спехом использовались в мно^очисленных исследованиях, направленных на из^чение а^тивации ^WntСС в различных т^а-нях, ^а^ на этапах эмбрионально^о, та^ и постнаталь-но^о развития, а та^же для выявления новых потенциальных мест си^нальной а^тивности ^WntСС. Во всех сл^чаях а^тивация э^спрессии lacZ совпадала с до^а-занной ф^н^цией ^WntСС в этих т^анях [5].

На TOPgal мышах была применена Xgal о^рас^а в поч^ах передних ^онечностей Е10 – Е14 (эмбриональный день 10 – 14) мышиных эмбрионов (рис. 1). Отметим, что ^ Е10.5 эмбрионов была обнар^-жена Xgal о^рас^а, свидетельств^ющая об а^тивнос-ти ^WntСС в ^лет^ах, в дорзальной и вентральной поверхностной э^тодерме (длинные стрел^и на рис. 1,А) и в апи^альном э^тодермальном ^ребне (АЭГ) (^орот^ая стрел^а на рис. 1,А). Помимо это^о была из^чена Xgal о^рас^а на поперечных срезах, проходящих через поч^^ передней ^онечности (рис. 1,Б). Установлено, что ^роме поверхностной э^тодермы и АЭГ, Xgal о^рас^а прис^тств^ет в мезенхиме, непосредственно прилежащей ^ поверхностной э^то-дерме (длинные стрел^и на рис. 1,Б), но отс^тств^ет в зоне ^плотнения мезенхимы – зародышевой зоны формирования б^д^щей ^ости (по^азана прерывистой линией на рис. 1,Б). Обнар^женный паттерн Xgal о^рас^и хорошо ^оррелир^ет с известным паттерном э^спрессии Wnt си^нальных моле^^л (Wnt5A, Wnt7A и Wnt3) на стадии ранне^о развития ^онечнос-ти [9]. Э^спрессия Wnt7A ^становлена в дорзальной поверхностной э^тодерме, ^де Wnt7A, действ^я через ^аноничес^^ю и не^аноничес^^ю Wnt си^наль-ные системы, ре^^лир^ет процессы развития дорзальной стороны ^онечности и ^частв^ет в поддержании паттерна э^спрессии ^енов вдоль дорзальновентральной оси ^онечности [1]. Э^спрессия Wnt3 по^азана в АЭГ, ^де Wnt3, являющийся а^тиватором ^WntСС, и^рает ^лючев^ю роль в поддержании ф^н-^ций АЭГ и формировании дистальных стр^^т^р ^о-нечности [7]. Wnt5A э^спрессир^ется в дистальной мезенхиме, ^де ре^^лир^ет ^леточн^ю пролиферацию и с^орость про^симально-дистально^о роста развивающейся ^онечности [9]. По^азанное в работе от-с^тствие Xgal о^рас^и в зоне ^плотнения мезенхимы (рис. 1,Б) подтверждает с^ществ^ющ^ю на настоящий момент ^ипотез^, что низ^ая а^тивность ^WntСС необходима для дифференцирования мезенхимы в хондроциты, а а^тивация ^WntСС подавляет дифференциров^^ ^лето^ мезенхимы в хондроциты за счет взаимодействия межд^ b-^атенин и Sox9 [2].

У Е12.5 эмбрионов Xgal о^рас^а была обнар^же-на в зоне хондро^енно^о ^плотнения, развивающихся ^остей предплечья и плеча – л^чевой (Л^), ло^-тевой (Л) и плечевой (П) (рис. 1, В,Г, стрел^и ^^азы-вают на местоположение б^д^ще^о ло^тево^о с^с-тава). Важно, что Xgal о^рас^а не была обнар^жена в области формир^юще^ося ло^тево^о с^става, а та^-же в зоне, разделяющей ло^тев^ю и л^чев^ю ^ости (стрел^и на рис. 1, В,Г). Отс^тствие Xgal о^рас^и в области формир^юще^ося ло^тево^о с^става свиде-тельств^ет, что ^WntСС не и^рает а^тивной роли в формировании промеж^точной зоны и на ранних стадиях развития ло^тево^о с^става. Эти рез^льтаты противоречат ранее выс^азанной ^ипотезе [24], что ^WntСС подавляет хондро^енный потенциал ^лето^, находящихся в промеж^точной зоне, не позволяя им дифференцироваться в хондроциты и, та^им образом, обеспечивая формирование с^става. Действительно, пол^ченные нами данные по^азывают, что на этой стадии развития (Е12.5) Wnt4 (рис. 1,Д) и Wnt11 (рис. 1,Е) э^спрессир^ются в зоне ло^тево^о с^става (длинные стрел^и на рис. 1, Д,Е,Ж), а Wnt5A э^спрес-сир^ется в над^остнице (perichordium) плечевой ^о-сти (длинные стрел^и на рис. 1,Ж). Отметим та^же, что э^спрессия Wnt9A и Wnt16 была по^азана в районе с^ставов на ранних стадиях развития [21]. В польз^ ^помян^той ^ипотезы [25] та^же ^оворят данные, пол^ченные в э^спериментах с использованием Wnt4-/-;Wnt9A-/- мышей. Потеря э^спрессии Wnt4 и Wnt9A ^ та^их мышей привела ^ метаплазии и пол-ном^ сращению нес^оль^их с^ставов [24]. Более то^о, э^топичес^ая э^спрессия Col2a1 (специфичес^ий мар^ер хондроцитов) была по^азана в районе ло^-тево^о с^става Wnt4-/-;Wnt9A-/- мышей, что свиде-тельств^ет о возможной роли Wnt в ре^^ляции хонд-ро^енно^о потенциала ^лето^ промеж^точной зоны. В сово^^пности с данными о способности Wnt9A а^-тивировать ^WntСС, приведенные рез^льтаты ^ово-рят в польз^ а^тивной роли ^аноничес^о^о п^ти в развитии с^ставов. Одна^о рез^льтаты нашей работы не ^^ладываются в эт^ ^ипотез^. Они в большей мере свидетельств^ют, что ^WntСС не и^рает а^тив-ной роли в формировании промеж^точной зоны. Это подтверждают и недавно оп^бли^ованные рез^ль-таты работ, до^азывающие, что Wnt4 и Wnt11 являются не а^тиваторами, а, наоборот, ин^ибиторами ^WntСС [8, 17]. Наши рез^льтаты ^освенно подтверждаются данными, пол^ченными с использованием мышей, но^а^тированных по b-^атенин^[24]. В от-с^тствии b-^атенина (^лючево^о ^омпонента ^WntСС, без ^оторо^о ф^н^ционирование этой системы невозможно) ^ этих мышей сохранялась э^спрессия ^енных мар^еров, хара^терных для ^лето^ проме-ж^точной зоны развивающихся с^ставов, что до^а-зывает отс^тствие значимой роли ^WntСС в ре^^ля-ции или поддержании фенотипа ^лето^ промеж^-точной зоны с^ставов.

На основании пол^ченных рез^льтатов и приведенных выше данных др^^их авторов мы пола^аем , что ^WntСС не а^тивен на ранних этапах развития с^-ставов и формирования промеж^точной зоны, и что дефе^ты развития с^ставов, описанные ^ Wnt4-/-;Wnt9A-/- мышей, связаны с возможной ролью этих си^нальных моле^^л в а^тивации не^аноничес^ой Wnt си^нальной системы.

У Е14.5 эмбрионов мы обнар^жили яр^^ю Xgal о^рас^^ в районе развивающихся тр^бчатых ^остей (л^чевой, ло^тевой и плечевой) и пальцевых фалан^ (рис. 1, З,И,К). Хара^терно, что, ^а^ и в сл^чае Е12.5, Xgal о^рас^а отс^тствовала в районе формир^юще-^ося ло^тево^о с^става (длинные стрел^и на рис. 1,I) и с^ставов межд^ фалан^ами пальцев (^орот^ие стрел^и на рис. 1, З,И). Последнее соответств^ет ре-з^льтатам, пол^ченным с использованием Е12.5 эмбрионов, и подтверждает мысль, что ^WntСС не а^-тивна в ^лет^ах промеж^точной зоны на ранних эмбриональных стадиях развития с^ставов.

Арти^^лярные хондроциты – вытян^тые, веретенообразные ^лет^и, ^оторые и^рают ^лючев^ю роль в развитии и поддержании ф^н^ций синовиальных с^ставов. Предпола^ается, что арти^^лярные хондроциты происходят из ^лето^ промеж^точной зоны, или из ^лето^, расположенных в пролиферативной части зоны роста (growth plate) тр^бчатых ^остей [16, 22].

В работе был использован метод имм^но^исто-химии (ИГХ) с антителами, специфичес^и связывающимися с doublecortin (DCX), чтобы пометить арти^^-лярные хондроциты. Подчер^нем, что DCX является специфичес^им мар^ером арти^^лярных хондроци- тов, а э^спрессия DCX не обнар^жена в хондроцитах, ^частв^ющих в формировании ^остной т^ани [27].

Для из^чения роли ^WntСС в развитии арти^^ляр-ных хондроцитов были помечены срезы через ло^-тевой с^став TOPgal мышей на стадиях эмбриональ-но^о (Е14.5 и Е18.5) и постнатально^о (P7, P10) развития антителами ^ lacZ и DCX.

Хондроциты диффернцир^ются из ^лето^ мезенхимы в процессе ^плотнения (^онденсация) мезенхимы [3]. В работе мы из^чили э^спрессию ^леточ-ных мар^еров, хара^терных для ^лето^ мезенхимы и арти^^лярных хондроцитов одновременно с оцен-^ой а^тивности ^WntСС в этих ^лет^ах. У Е14.5 эмбрионов мезенхимальные ^лет^и, помеченные антителами ^ Vinculin (^расная мет^а на рис. 2,А), наблюдались в нар^жных слоях формир^ющейся про-меж^точной зоны, в то время ^а^ арти^^лярные хондроциты (помечены антителами ^ DCX, зеленая мет-^а на рис. 2,А) распола^ались в среднем слое про-меж^точной зоны (см. рис. 2, А1). Интересно, что мно^ие из DCX положительных ^лето^ (арти^^ляр-ные хондроциты) та^же были помечены антителами ^ Vinculin (длинные стрел^и на рис. 2,А1). Это свидетельств^ет, что на данной стадии эмбриональ-но^о развития (Е14.5) э^спрессия ^леточных мар-^еров, хара^терных для мезенхимы, по-прежнем^ обнар^живается в дифференцир^ющихся арти^^-лярных хондроцитах.

С целью из^чения а^тивности ^WntСС были помечены срезы через переднюю ^онечность эмбрионов TOPgal мышей (Е14.5) антителами ^ Vinculin и lacZ (рис. 2, Б,Б1). Интенсивная lacZ о^рас^а была обнар^жена в хондроцитах, расположенных в зоне роста длинных ^остей (звездоч^а на рис. 2, Б). Клет^и мезенхимы (Vinculin+ ^лет^и), расположенные во внешних слоях промеж^точной зоны, прилежащих ^ зоне роста ^ости, были помечены антителами ^ Vinculin и lacZ (Vinculin+ и lacZ+) (рис. 2, Б1). Это свидетельств^ет, что ^WntСС а^тивен в ^лет^ах мезенхимы промеж^-точной зоны. Важно, что о^рас^а срезов, проходящих через передние ^онечности Е14.5 TOPgal эмбрионов, с антителами ^ lacZ (^расная о^рас^а) и DCX (зеленая о^рас^а) по^азала, что толь^о малая часть арти^^ляр-ных хондроцитов (DCX+ ^лет^и), расположенныех в непосредственной близости от зоны lacZ+ ^лето^ мезенхимы, были помечены одновременно lacZ и DCX антителами (стрел^и на рис. 2, В). Это свиде-тельств^ет, что ^WntСС а^тивна толь^о в малой части арти^^лярных хондроцитов на данной стадии развития (Е14.5).

У Е18.5 эмбрионов арти^^лярные хондроциты (DCX+ ^лет^и веретенообразной формы) формир^-ют слой ^лето^ (толщиной в 2-3 ^лет^и) на поверхности эпифиза ^остей, входящих в ло^тевой с^став (зеленая о^рас^а на рис. 2, Г,Г1). Важно, что в отличие от данных, пол^ченных на Е14.5 эмбрионах, большинство арти^^лярных (DCX+) хондроцитов та^же lacZ+ (т.е. метятся антителами ^ lacZ) (длинные стрел^и на рис. 2,Г1). Это свидетельств^ет, что на данной стадии развития (Е18.5) ^WntСС а^тивна в большинстве (если не во всех) арти^^лярных хондроцитах. О^рас^а с антителами ^ Vinculin была обнар^жена толь^о на поверхности эпифиза; ни одной ^лет^и, помеченной одновременно антителами ^ Vinculin и ^ DCX или lacZ, на данном этапе развития обнар^жено не было (рис. 2,Д).

Была использована о^рас^^ с Xgal и методы ИГХ для анализа а^тивности ^WntСС в арти^^лярных хондроцитах на стадиях постнатально^о развития. Xgal о^рас^а продольных срезов через эпифиз бедрен -ной ^ости (рис. 3, А,А1), пол^ченных ^ постнатальных (P) 7 TOPgal мышей выявила наличие множества Xgal+ веретенообразных ^лето^, расположенных в поверхностном слое (^иалиновом хряще)

эпифиза (длинные стрел^и на рис. 3,А1). Сходные рез^льтаты были пол^чены с использованием ИГХ с антителами ^ lacZ на срезах эпифиза, взятых ^ P10 TOPgal мышей (рис. 3Б). Хара^терные веретенообразные lacZ+ ^лет^и расположены в поверхностном слое (^иалиновом хряще) эпифиза (стрел-^и на рис. 3, Б1); не^оторые из этих ^лето^ были та^же DCX+ (стрел^и на рис. 3, Б2). Наложение этих фото^рафий (Рис. 3Б3) по^азывает, что часть арти -^^лярных хондроцитов (DCX+ ^лет^и) та^же lacZ+ (стрел^и на рис. 3,Б3). Это до^азывает, что ^WntСС а^тивна в арти^^лярных хондроцитах на этапах по-стнатально^о развития.

Для из^чения а^тивности KWnt в арти^^лярных хондроцитах взрослых животных, были о^рашены срезы через ло^тевой с^став, взятые ^ TOPgal мышей в возрасте 6 месяцев, использ^я ИГХ с антителами ^ lacZ и DCX (рис. 3, В,Г). Мно^очисленные DCX+ ^лет^и (арти^^лярные хондроциты) были об-нар^жены в поверхностном слое ^иалиново^о хря -ща с^ставной поверхности (рис. 3,В). ИГХ с использованием антител ^ lacZ по^азала, что а^тивность ^WntСС отс^тств^ет в ^лет^ах, расположенных в поверхностном слое эпифиза, но а^тивна в ^леточ -ной поп^ляции, расположенной во вн^тренней зоне эпифиза ^ости (длинные стрел^и на рис. 3,Г); мы не смо^ли обнар^жить ^лет^и с двойной DCX+ и lacZ+ о^рас^ой. Важно та^же, что lacZ+ ^лет^и полностью отс^тствовали в поверхностном слое ^иа-линово^о хряща.

Та^им образом, рез^льтаты нашей работы свиде-тельств^ют, что ^WntСС неа^тивна в арти^^лярных хондроцитах ^иалиново^о хряща в синовиальных с^-ставах взрослых животных. Засл^живает внимания выявленная нами поп^ляция lacZ+ ^лето^, распола^а-ющаяся во вн^треннем слое эпифиза. Ка^ ^станов-лено, а^тивация ^WntСС в ^леточной поп^ляции ^ взрослых животных и челове^а является хара^тер-ной чертой их принадлежности ^ стволовым ^лет^ам, раположенным в этой т^ани [4, 18, 19]. Действительно, стволовые ^лет^и были ^спешно изолированы из ^иалиново^о хряща, пол^ченно^о из с^става взрос-ло^о челове^а [11].

В процессе исследования мы не обнар^жили lacZ+ ^лето^ в ^иалиновом хряще, но поп^ляция lacZ+ ^ле-то^ была найдена в зоне эпифиза, непосредственно примы^ающей ^ ^иалиновом^ хрящ^ (рис. 3, В,Г). Эти рез^льтаты треб^ют дальнейших исследований, на-првленных на выявление роли и ф^н^ции lacZ+ ^ле-то^ в ре^енерации ^иалиново^о хряща и эпифиза ^о-сти, поврежденных вследствие старения или болезни. Др^^ими словами, необходимо выяснить являются ли эти ^лет^и действительно стволовыми ^лет^а-ми, способными дифференцировать в арти^^лярные хондроциты.

Пол^ченные рез^льтаты достаточно ^бедитель-но свидетельств^ют – ^аноничес^ая Wnt си^наль-ная система не а^тивна на ранних стадия эмбрио-нально^о развития с^ставов (стадия формирования промеж^точной зоны), что противоречит ^и-потезе ^частия ^WntСС в ре^^ляции дифференци -ров^и ^лето^ промеж^точной зоны. Наши данные по^азывают, что а^тивность ^WntСС динамично изменяется в процессе развития арти^^лярных хондроцитов ^иалиново^о хряща. Мы ^становили, что ^WntСС не а^тивна в дифференцир^ющих арти^^-лярных хондроцитах на ранних стадиях развития (Е14.5) и в арти^^лярных хондроцитах с^ставов взрослых животных, но а^тивна на этапах поздне-^о эмбрионально^о (Е18.5) и постнатально^о развития (Р7 – Р10). Что ^асается биоло^ичес^ой роли и механизмов обнар^женной нами ре^^ляции а^-тивности ^WntСС в арти^^лярных ходроцитах, то они треб^ют дальнейше^о из^чения.

Рис. 1. А^тивность ^WntСС на ранних этапах эмбрионально^о развития. А – Xgal о^рас^а Е10.5 TOPgal эмбрионов; Б – Xgal о^рас^а поперечных срезов через поч^^ передней ^онечности Е10.5 TOPgal эмбрионов; В,Г – Xgal о^рас^а срезов через передние ^онечности Е12.5 TOPgal эмбрионов (Л^, л^чевая ^ость; Л, ло^тевая ^ость; П, плечевая ^ость); Д,Е,Ж – In situ ^ибридизация на срезах через передние ^онечности Е12.5 эмбрионов Д – Wnt4, Е – Wnt11, Ж – Wnt5A); З,И,К – Xgal о^рас^а срезов через переднюю ^онечность Е14.5 TOPgal эмбрионов