Активность компонентов антиоксидантной защиты Raphanus sativus L. при выращивании на почве, загрязненной сульфатами свинца и кадмия

Повышенное содержание тяжелых металлов в почвенной среде приводит к ингибированию роста, изменению интенсивности и направленности многих метаболических процессов в клетках растений. Известно, что тяжелые металлы при низкой концентрации выполняют роль важнейших микроэлементов, необходимых для нормального роста и развития растений. Однако остается неизвестной физиологическая роль Cd и Pb. При загрязнении растения поглощают эти элементы, избирательно аккумулируют в корнях и надземных вегетативных органах. При избыточном накоплении в растительных клетках свинца и кадмия нарушается гомеостаз и подавляются многие процессы метаболизма [Sanita di Toppi, Gabrielli, 1991; Серегин, Иванов, 2001]. Ингибирующее влияние Cd и Pb на активность большинства ферментов обусловлено как прямым связыванием с функциональными SH-группами белков, так и с нарушением ионного баланса за счет конкурентного снижения поглощения и нарушения транспорта Zn, Fe, Cu и др. [Титов, Таланова, Казнина, 2011].

Под влиянием неблагоприятных условий среды и, в частности, техногенного загрязнения в клетках растений происходит развитие окислительного стресса с избыточным образованием активных форм кислорода (АФК) [Зенков, Лапкин, Меньшикова, 2001; Чиркова, 2002; Га-рифзянов, 2012; Сигнальная роль ..., 2012]. К основным механизмам устойчивости растений к дей- ствию поллютантов относят активацию ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутаза, пероксидазы, каталаза и др.), а также накопление редокс-соединений (аскорбиновая кислота, глутатион, каротиноиды и др.), прерывающих цепи избыточного образования свободных радикалов [Fridovich, 1986, Кения, Лукаш, Гуськов, 1993; Mittler, 2002; Прадедова, Ишеева, Саляев, 2011].

Повышение активности компонентов антиоксидантной системы защиты может определять уровень адаптационных способностей растений к действию антропогенных загрязнителей. Однако особенности функционирования антиоксидантной системы растений в условиях загрязнения среды тяжелыми металлами изучены недостаточно. В связи с этим целью работы явилось исследование активности некоторых компонентов антиоксидантной защиты редиса посевного при выращивании на почве, загрязненной сульфатами свинца и кадмия.

Объект и методы исследования

Объектом исследований был редис посевной ( Raphanus sativus L. var. radicula Pers., Brassicaceae ) сорта Жара. Растения выращивали в условиях модельного эксперимента в течение 30 дней на агро-дерново-подзолистой почве на фоне внесения сульфатов свинца (1, 5 и 10 ПДК, при ПДК=100 мг/кг почвы) и кадмия (1, 50, 100 ПДК, при ПДК=3 мг/кг

почвы). Контролем служили растения, выращенные на незагрязненной почве. Повторность опытов – трехкратная. Определение массы и высоты надземной части растений проводили в 20-кратной повторности. Биохимические показатели устанавливали в 3-кратной повторности. Общее содержание перекисей определяли ферротиоционатным методом [Лу-каткин, 2002]; активность каталазы – газометрическим методом [Методы ..., 1987]; активность пероксидаз – по методу Бояркина [Методы ..., 1987]. Содержание аскорбиновой кислоты и общую редокс-активность изучали методом Петта – Прокошева [Практикум …, 1972].

Полученные результаты статистически обработаны с помощью компьютерной программы «Stadia 8.0»; были использованы дисперсионный и регрессионный анализы.

Результаты и их обсуждение

Загрязнение почвы солью свинца не оказало достоверного воздействия на высоту растений (рис. 1). В ряде работ показана низкая проникающая способность свинца в растительный организм [Ильин, 1991; Серегин, Иванов, 1997; Еремченко, Чудинова, 2012]. При невысоких концентрациях тяжелых металлов в клетке изменение физиологобиохимических реакций носит неповреждающий и обратимый характер. Согласованность метаболических процессов сохраняется, а иногда даже наблюдается интенсификация некоторых из них [Титов, Таланова, Казнина, 2011].

Рис. 1 . Влияние сульфатов свинца и кадмия на высоту растений редиса, см

Достоверное снижение высоты растений прослежено по вариантам Cd 50 и 100 ПДК (рис. 1). Торможение роста надземной части растений связывают как с непосредственным влиянием кадмия на клеточное деление, так и с нарушением общего метаболизма растений; отмечено уменьшение фотосинтезирующей поверхности, замедление скорости фотосинтеза, нарушение минерального питания, а также изменение гормонального баланса, в частности, увеличение количества абсцизовой кислоты [Иванов, Быстрова, Серегин, 2003; Титов, Казнина, Таланова, 2012].

Токсическое воздействие на массу растений оказало загрязнение Pb и Cd (табл. 2), однако исходя из внесенных доз солей, эффект действия кадмия проявлялся на порядок сильнее (рис. 2).

Рис. 2 . Влияние сульфатов свинца и кадмия на сырую массу надземной части растений, г

Как известно, поллютанты (в том числе тяжелые металлы) инициируют развитие в клетках живых организмов окислительного стресса, обязательным условием возникновения которого является избыточное образование активных форм кислорода, таких как супероксид-радикал (анион-ради-кал) О 2 •-, гидроперекисный радикал НО 2 •, гидрок-сил-радикал НО•, перекись водорода Н 2 О 2 , синглетный кислород ¹О 2 . В результате повышенной генерации АФК в клетках происходят окисление липидов, углеводов, белков, повреждение ДНК и РНК, дезорганизация цитоскелета. Перекись водорода является относительно стабильным соединением (время жизни около 1 мс), способным диффундировать от места образования [Гарифзянов, 2012]. Её генерация может служить одним из биохимических показателей состояния растений в условиях нарушения внутриклеточных процессов.

Дисперсионный анализ подтвердил достоверное влияние фактора загрязнения почвы на содержание перекисей в листьях растений. В то же время количество перекисей зависело не только от их продуцирования, но и от эффективности работы антиоксидантной системы. На фоне действия соли свинца содержание перекисей в листьях растений повышено на вариантах 5 и 10 ПДК по сравнению с контрольными растениями (рис. 3).

Рис. 3 . Влияние сульфатов свинца и кадмия на содержание перекисей в листьях редиса, мМ на 100 г сырой массы

Возможно, в этом случае накопление Н2О2 в клетках при стрессе связано с его сигнальной ро- лью, обеспечивающей включение защитных механизмов [Гамалей, Клюбин, 1996]. В вариантах с более токсичным кадмием содержание перекисей ниже контроля, по-видимому, из-за повышенной активности систем антиоксидантной защиты растений.

Избыток пероксида водорода, возникающий при действии стрессовых факторов, элиминируется каталазой и пероксидазами [Мирошниченко, 1992; Мерзляк, 1999; Роль систем …, 2008]. Наличие нескольких ферментов, выполняющих одну и ту же каталитическую функцию, расширяет адаптационный потенциал растений [Половникова, Воскресенская, 2008]. Каталаза преобразует перекись водорода в воду и молекулярный кислород. Она участвует в аскорбат-глутатионовом цикле, регулирующем окислительно-восстановительное равновесие в клетке. Поскольку каталаза и пероксидаза предотвращают избыточную аккумуляцию АФК и снижают вероятность развития окислительного стресса, изменения в их активности рассматривают как ранний и чувствительный индикатор токсичности тяжелых металлов [Иванов, Савочкин, Кузнецов, 2012].

В научной литературе отмечается разная реакция растений на воздействие поллютантов. В опытах М.Г. Половниковой и О.Л. Воскресенской [2008] при усилении загрязнения среды поллютантами наблюдалось снижение активности каталазы, особенно у менее устойчивого к антропогенному воздействию клевера лугового. В.О. Миттова и А.У. Игамбердиев [2000] считают, что в стрессовых условиях общая активность каталазы снижается, но увеличивается активность изоформ каталазы, обладающих пероксидазной активностью. Более высокий уровень активности каталазы в стрессовых условиях отмечен в исследованиях Т.В. Чирковой [2002] и П. Ахмада, К.А. Джамила, С. Шармы [2010].

Сульфат свинца в дозе Pb 1 ПДК не оказал достоверного влияния на активность каталазы в листьях растений (рис. 4). При повышенном загрязнении свинцом и наименьшей дозе кадмия зафиксировано снижение активности этого фермента. Вероятно, в адаптации растений на этом фоне имеют значения другие антиоксиданты. Под влиянием Cd 50 ПДК отмечено усиление активности каталазы в листьях растений в 1.5 раза по сравнению с контролем.

В результате поиска связей между биохимическими показателями установлена обратная экспоненциальная зависимость между общим количеством перекисей и активностью каталазы: y =e^0,25 – 0.3х ; уровень значимости нулевой гипотезы P=0.0004; критерий Фишера F=11.3. Следовательно, чем выше активность каталазы, тем ниже содержание перекисей в листьях

В реализации адаптационного потенциала особая роль отводится пероксидазам (аскорбат-перок-сидаза, глутатион-пероксидаза, гваякол-пероксида-за и др.) – полифункциональной ферментной системе, которая способна реагировать на широкий спектр факторов, приводящих к нарушению обмена веществ у растений. Пероксидазы способны восстанавливать перекись водорода до воды, окисляя при этом различные соединения [Лукаткин, 2002].

Рис. 4 . Влияние сульфатов свинца и кадмия на активность каталазы в листьях редиса, мл О 2 за 3 мин на 1 г сырой массы

Проведенные опыты показали, что внесение в почву сульфата свинца не сопровождалось усилением пероксидазной активности растений редиса (рис. 5). В варианте с внесением кадмия наблюдалось статистически достоверное увеличение активности пероксидаз по сравнению с контролем. Усиление активности пероксидаз при действии стресс-факторов и, в частности, тяжелых металлов, может быть связано с изменениями их компонентного состава. Ферменты находятся в клетке как в свободном, так и в связанном состоянии, а под влиянием стресса происходит увеличение доли свободных форм за счет освобождения из связанных форм [Рогожин, 2004].

Рис. 5 . Влияние сульфатов свинца и кадмия на активность пероксидаз в листьях редиса, оптическая плотность (ОП) за 1 с на 1 г сырой массы

Повышение пероксидазной и каталазной активности в листьях редиса под влиянием CdSO 4 приводит к сохранению прооксидантно – оксидантного равновесия в биологических мембранах и свидетельствует об активации защитных механизмов от окислительного стресса, вызванного действием тяжелых металлов.

В целом следует отметить усиленные признаки развития окислительного стресса в редисе под влиянием соли кадмия. Кадмий обладает большой подвижностью в почве в широком диапазоне рН и способностью замещать в клеточном метаболизме такой важный биоэлемент, как цинк [Серегин, Иванов, 2001]. Ионы Cd чрезвычайно легко поглощаются растениями [Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989], а Pb медленнее других тяжелых металлов поступает в растения и транспортируется в надземные органы [Серегин, Иванов, 1997]. Различия в степени ингибирующего действия исследуемых металлов могут быть связаны с эффективностью физиологических барьеров при поступлении микроэлементов в растение, с задержкой металлов в тканях корня или удалением их в вакуоли [Прасад, 2003].

Высокие параметры окислительно-восстановительных процессов в растениях являются показателем мобилизации защитных свойств организма. При окислительном стрессе ферментативная защита может дополняться протекторным действием низкомолекулярных антиоксидантов, таких как аскорбиновая кислота и глутатион, прерывающих цепь свободнорадикального окисления [Кения, Лукаш, Гуськов, 1993; Чиркова, 2002; Половникова, Воскресенская, 2008]. Аскорбиновая кислота реагирует с АФК, окисляясь при этом до моно - и де-гидроаскорбиновой кислоты.

В растениях редиса с увеличением загрязненности сульфатом свинца и кадмия повышалось содержание аскорбиновой кислоты, способной к восстановительным реакциям (рис. 6). Самый высокий уровень содержания аскорбиновой кислоты установлен при максимальных дозах тяжелых металлов – в 2 раза больше, чем в контроле. Накопление аскорбиновой кислоты может быть следствием интенсивности ее образования и/или освобождения из связанного состояния [Кения, Лукаш, Гуськов, 1993].

Рис. 6 . Влияние сульфатов свинца и кадмия на содержание свободной аскорбиновой кислоты (АК) в листьях редиса, мг/% сухой массы растений

С увеличением дозы кадмия и свинца повысилась и общая редокс-активность в листьях редиса по сравнению с контролем (рис. 7).

Выводы

• 1.    Загрязнение почвы сульфатами свинца и кадмия оказало ингибирующее влияние на массу растений редиса. Достоверное уменьшение высоты растений отмечено в вариантах с солью кадмия, при дозах Cd 50 и 100 ПДК.

• 2.    Достоверное накопление перекисей в надземных органах редиса установлено на вариантах загрязнения почвы сульфатом свинца в дозе 5 и 10 ПДК относительно контроля. На вариантах с сульфатом кадмия перекисей в листьях было меньше, чем на контроле.

• 3.    При увеличении содержания сульфата кадмия в почве отмечено повышение активности каталазы и пероксидаз в листьях редиса по сравнению с контролем. При загрязнении почвы солью свинца активность каталазы в листьях редиса понижена, не отмечено усиления пероксидазной активности.

• 4.    Установлено заметное усиление редокс-ак-тивности в листьях редиса в условиях загрязнения почвы свинцом и кадмием, что, вероятно, является одним из защитно-приспособительных реакций при избыточной генерации активных форм кислорода.

Рис. 7 . Влияние сульфатов свинца и кадмия на общую редокс-активность (ОРА) в листьях редиса, мл 0,001 н. KJO 3 /100г сухой массы