Активность лизосомальных гидролаз у молоди кумжи (Salmo trutta L.) из приполярной реки Ольховка

Кумжа (Salmo trutta L., сем. Salmonidae) – пластичный вид со сложной популяционно-генетической структурой, представленный проходной, озерной и ручьевой формами, обитает в водоемах северного полушария (бассейн Атлантического океана) и является одним из ценнейших промысловых видов лососевых рыб [14]. Условия жизни в речной период чрезвычайно важны для пополнения популяции кумжи. Период раннего онтогенеза рыб характеризуется существенными морфологическими и функциональными преобразованиями, сопровождающи- мися кардинальными перестройками клеточного метаболизма [8]. Процессы роста и развития обеспечиваются деятельностью целого комплекса механизмов, среди которых особую роль играют биохимические механизмы обмена белковых и нуклеиновых компонентов клетки [22]. Лизосомы, содержащие комплекс гидролитических ферментов, способных расщеплять все органические компоненты клетки, выполняют важную реконструктивную и защитную функцию, обеспечивая метаболические превращения в организме, в том числе в периоды раннего развития и интенсивного роста [1], [3], [10]. Поэтому представлялось

интересным провести исследование динамики изменения активности лизосомальных ферментов в процессе роста молоди кумжи начиная с этапа выхода личинок из нерестовых гнезд и до возраста 4+.

В настоящей статье приводятся данные о динамике активности лизосомальных нуклеаз (РНКазы и ДНКазы) и протеиназ (катепсинов В и D) у кумжи разных возрастных групп (0+, 1+, 2+, 3+ и 4+), отловленной в одном биотопе – приполярной реке Ольховка (бассейн Белого моря).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы химические реагенты и субстраты протеиназ и нуклеаз, произведенные «Sigma-Aldrich» (США); приборы ЦКП НО ИБ КарНЦ РАН: гомогенизатор Tissue Lyser LT (Qiagen, Германия), центрифуга Allegra 64R (Beckman Coulter, США), термостатирующая водяная баня UT-4334 (Россия), спектрофотометр СФ-2000 (ЗАО «ОКБ-Спектр», Россия).

Материал

Отлов молоди кумжи разных возрастов проводили на пороговых и перекатных участках реки Ольховка в середине июня (температура воды 11,5 °С) с помощью аппарата электролова Fa-2 («Фирма», Норвегия). Состав и объем кормовой базы для молоди кумжи, ведущей в речных условиях оседлый образ жизни на индивидуальных микростациях на порогах и перекатах, идентичен и содержит различные виды воздушных и наземных насекомых, а также водных организмов – личинок ручейников, нимф поденок и веснянок [14]. Основной прирост молоди происходит летом, при температуре воды 10–17 °С. После вылова молодь выдерживали около суток в садках, затем помещали в жидкий азот и транспортировали в лабораторию для дальнейших биохимических исследований.

Количественное содержание растворимого белка в тканях (мг/г ткани) определяли по методу М. Бредфорд [19], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Определение активности лизосомальных ферментов

Активность лизосомальных протеиназ. Цистеиновая протеиназа, катепсин В (КФ 3.4.22.1), и аспартатная, катепсин D (КФ 3.4.23.5), – основные протеиназы лизосом [18]. После гомогенизации образцов в соотношении 1 : 10 (вес/об.) в растворе 0,25 М сахарозы с добавлением 0,01 % Тритона Х-100 (Merck) (1200 об./мин, 60 с) и их центрифугирования (10 000 g, 30 мин), в супернатанте определяли активность катепсина В по расщеплению 0,065 M раствора этилового эфира гидрохлорида N-бензоил L-аргинина в 0,1 M ацетатном буфере (pH 5,0) [24] и катепсина D по гидролизу 1 %-го бычьего гемоглобина в 0,1 М ацетатном буфере (рН 3,6) согласно модифицированному методу Ансона [16]. Активность катепсинов B и D (ед. акт.) выражали в единицах изменения оптического поглощения при Е525 и Е280 соответственно, на 1 мг белка за 1 ч инкубации (37 °C).

Активность лизосомальных нуклеаз. Определение активности РНКазы (КФ 3.1.4.23) и ДНКазы (КФ 3.1.4.6) проводили по методам А. П. Левицкого с соавт. [4] и А. А. Покровского с соавт. [9]. В качестве субстратов использовали 0,1 % растворы РНК и ДНК в 0,2 М ацетатном буфере (pH 5,2 и 5,0 соответственно). Количество низкомолекулярных продуктов гидролиза нуклеиновых кислот определяли спектрофотометрически при 260 нм после осаждения нерасщепленных нуклеиновых кислот и их крупных фрагментов 0,5 М раствором хлорной кислоты или 0,25%-ным уранилацетатом в 0,5 М хлорной кислоте (для ДНК и РНК соответственно). Активность ферментов выражали в условных единицах (ед. акт.) изменения оптического поглощения при 260 нм в расчете на 1 мг белка за 1 ч инкубации (30 °C).

Полученные данные обработаны статистически с помощью Microsoft Office Excel 2007. Результаты представлены в виде средних и их ошибок (М ± m). Достоверность различий оценивалась по непараметрическому критерию U Вилкоксо-на – Манна – Уитни при уровне значимости р ≤ 0,05 [2].

Экспериментальные работы выполнены с использованием оборудования ЦКП Института биологии КарНЦ РАН.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В табл. 1 приведены данные, свидетельствующие о том, что в течение первого года жизни

Таблица 1

Размерно-весовые характеристики молоди кумжи Salmo trutta L . , n = 5

Показатели	Возраст
	0+	1+	2+	3+	4+
Длина тела, см	2,6 ± 0,10	5,4 ± 0,3	9,1 ± 0,4	13,3 ± 0,6	16,5 ± 0,2
Масса тела, г	0,11 ± 0,1	1,5 ± 0,1	7,28 ± 0,6	22,56 ± 0,4	46,4 ± 0,5
n	6	5	5	5	5

Таблица 2

Активность лизосомальных гидролаз (катепсинов и нуклеаз) у молоди кумжи разных возрастов; n = 5

Орган	Возраст	Активность ферментов, ед. акт.
		Катепсин B	Катепсин D	Кислая РНКаза	Кислая ДНКаза
Личинка целиком	0+	1,80 ± 0,10	2,00 ± 0,15	0,46 ± 0,06	0,16 ± 0,05
Печень	1+	0,60 ± 0,0	0,30 ± 0,0	0,31 ± 0,00	0,07 ± 0,00
	2+	0,50 ± 0,10	0,14 ± 0,03	0,20 ± 0,02	0,07 ± 0,02
	3+	0,50 ± 0,02	0,25 ± 0,04	0,18 ± 0,01	0,07 ± 0,02
	4+	0,55 ± 0,02	0,20 ± 0,06	0,14 ± 0,01	0,05 ± 0,00
Мышцы	1+	0,47 ± 0,06	0,07 ± 0,01	0,17 ± 0,02	0,07 ± 0,02
	2+	0,37 ± 0,06	0,04 ± 0,0	0,14 ± 0,03	0,07 ± 0,03
	3+	0,33 ± 0,08	0,02 ± 0,0	0,11 ± 0,03	0,06 ± 0,01
	4+	0,50 ± 0,07	0,003 ± 0,0	0,11 ± 0,01	0,05 ± 0,00

(от 0+ до 1+) масса тела молоди кумжи возрастает более чем в 10 раз. Затем масса исследуемой молоди увеличивается меньшими темпами: в возрасте 2+, 3+ и 4+ она выше по сравнению с сеголетками в 5, 3 и 2 раза соответственно. Длина молоди кумжи от стадии 0+ до 4+ увеличивается линейно примерно в 8 раз – от 2,6 до 16,5 см.

Результаты изучения динамики активности исследуемых лизосомальных гидролаз (катепсинов и нуклеаз) у молоди кумжи различных возрастов представлены в табл. 2.

Максимальная активность исследуемых ферментов обнаружена у молоди кумжи возраста 0+. В данной группе активность ферментов определяли в целом организме личинки, поскольку ее вес составлял всего 0,11 г (табл. 1), что не давало возможности препарировать ее органы. На последующих стадиях роста и развития молоди активность ферментов определяли в печени и скелетных мышцах, которые, как известно, составляют до 70 % веса тела личинки кумжи. Активность катепсинов В и D в печени и мышцах молоди кумжи по мере роста и развития от стадии 1+ до стадии 4+ изменялась незначительно с тенденцией к снижению и составляла от таковой на стадии 0+ (сразу после выхода из нерестовых гнезд) примерно 25 % для катепсина В, 2 и 11 % в печени и мышцах соответственно для катепсина D. Такие же возрастные тенденции были обнаружены в изменении активности лизосомальных нуклеаз: активность РНКазы и ДНКазы снижалась приблизительно на 43 и 28 % в печени и на 43 и 38 % в мышцах соответственно по отношению к таковой у личинок возраста 0+. При этом значения ДНКазной активности у молоди кумжи всех исследуемых возрастов были примерно втрое ниже РНКазной. В печени молоди всех возрастных групп была выявлена сравнительно более высокая активность изученных гидролаз, чем в мышцах. Эти изменения активности лизосомальных ферментов сопровождались увеличением содержания растворимого белка по мере роста и развития рыб (рисунок).

личинка целиком "печень "мышцы

Содержание растворимого белка у молоди кумжи разных возрастов (0+, 1+, 2+, 3+, 4+), n = 5

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Показанное увеличение массы тела кумжи по мере развития от сеголеток до пестряток и смолтов (2+…5+) отражает интенсивность роста молоди, напрямую связанную с накоплением костной и мышечной тканей, причем последняя играет особенно важную роль в ростовых процессах у рыб [20]. В данном исследовании показано, что наиболее значительный прирост массы тела наблюдается на первом году жизни молоди. Анализ данных показал, что темп роста молоди кумжи в данном регионе значительно выше, чем молоди атлантического лосося. Например, сеголетки рыб, выловленные в одни и те же сроки (сентябрь 2004 года) из близко расположенных водоемов, значительно различались по длине и массе. Длина АВ сеголетков кумжи из ручья Ольховка на 25 %, а вес на 133 % превышали аналогичные показатели сеголетков лосося из р. Ин- деры. Сходная картина наблюдалась и для более старших возрастных групп лососевых рыб. Так, пестрятки кумжи (1+) из ручья Собачий были больше по длине и массе (на 49 и 190 % соответственно) пестряток лосося из близко расположенного ручья Пятка. Ранее было показано [15], что в возрасте 2+ у молоди кумжи показатели длины и массы также выше, чем у лосося (на 58 и 338 % соответственно).

Процесс роста – преобразования пищевых веществ и энергии – имеет у рыб свои особенности, связанные с его недетерминированностью, в основе которой лежит преобладание синтетических процессов над катаболическими на протяжении всего жизненного цикла [5], [21], [23], [25]. Интенсивность белковой деградации служит регуляторным фактором недетерминированного роста рыб, свойственного большинству представителей класса Костистых рыб (Teleostei), включая лососевых. Синтезированные белки используются не только для построения структур и тканей молоди рыб, но и выполняют каталитическую и регуляторную функции в организме. Уровень активности основных лизосомальных протеиназ рыб – катепсинов В и D – у сеголеток (0+) кумжи имеет сравнительно высокие значения, свидетельствующие о высокой интенсивности лизосомального протеолиза, связанной, скорее всего, с задачами обеспечения «строительными блоками» (аминокислотами и пептидами) биосинтетических процессов накопления белка, необходимого для последующих структурных преобразований растущей молоди в период, когда завершается эндогенное питание и начинается переход на смешанное питание (при повышении температуры воды выше 11 °С, июнь, 500 градусо-дней). Далее, по мере роста и развития молоди кумжи, активность катепсинов в исследуемых органах изменяется незначительно (вариабельность 15–20 %), оставаясь на более низком уровне по сравнению с таковой у личинок после выклева и выхода из нерестовых гнезд (возраста 0+). В печени молоди кумжи всех изученных возрастов активность лизосомальных протеиназ, особенно катепсина D (в 5 раз), выше, чем в мышцах, что связано, вероятнее всего, с более высокой метаболической и функциональной (прежде всего синтетической) активностью печени.

Кислые нуклеазы (РНКаза и ДНКаза), локализованные в лизосомах, участвуют в расщеплении межнуклеотидных фосфодиэфирных связей в молекулах нуклеиновых кислот, которые, как известно, отвечают за передачу и хранение наследственной информации, а также ее реализацию в процессе трансляции, то есть биосинтеза белка в организме [11], [12], [17], [26]. Кислые нуклеазы осуществляют деградацию выполнивших свои функции биополимеров, тем самым обеспечивая организм компонентами для синтеза новых нуклеиновых кислот, принимающих участие в биосинтезе необходимых на новом этапе белковых веществ. Максимальная активность нуклеаз, так же как и протеиназ, обнаружена у сеголеток (0+) кумжи после их выхода из нерестовых гнезд. Ранее для молоди лосося было показано, что наиболее активные метаболические изменения связаны именно с ростом личинок в первый год жизни [5], [6], [7], [8], [13]. Можно полагать, что изменения уровня активности лизосомальных протеиназ (катепсинов В и D) и нуклеаз (РНКазы и ДНКазы) у молоди кумжи связаны с различиями в соотношениях процессов синтеза и деградации на разных стадиях развития личинок. В ранний период развития у рыб, как уже указывалось выше, преобладают синтетические процессы. Продукты, образующиеся при действии лизосомальных гидролаз у сеголеток кумжи, используются для компенсации пластических и энергетических затрат растущего организма, необходимых для метаболической перестройки при переходе от одной стадии развития мальков к другой. Успешная трансформация парров кумжи ведет к формированию смолтов, способных к миграции в море для последующего нагула.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выявленная динамика активности лизосомальных гидролаз у молоди кумжи в речной период жизни свидетельствует о наличии корреляции между активностью исследуемых ферментов и возрастом рыб, что указывает на участие лизосомальных ферментов в перестройках нуклеинового и тесно связанного с ним белкового обмена, сопровождающих процессы роста и раннего развития лососевых рыб, особенно на этапе выхода личинок из нерестовых гнезд.

* Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект №14-24-00102 «Лососевые рыбы Северо-Запада России: эколого-биохимические механизмы раннего развития».