Активность протолитических ферментов растений под воздействием лектинов эндофитных и эпифитных штаммов Azospirillum

Бактерии рода Azospirillum (альфа-субкласс протеобактерий) известны много лет как улучшающие рост растений ризобактерии (plant growth promoting rhizobacteria - PGPR) (Okon, Vanderleyden, 1997).

Бактерии обладают рядом очень важных свойств для эффективного ассоциативного взаимодействия с растениями - способностью к азотфиксации, продукции фитогормонов, солюбилизации фосфатов, улучшению водного и минерального статуса, продукции ряда соединений, увеличивающих мембранную активность и пролиферацию тканей корневой системы, уменьшать влияние стрессоров на растение и осуществлять контроль многочисленных фитопатогенов (Bashan et al. , 2004). Они были изолированы из ризосферы многих трав и злаков, произрастающих как в тропическом так и в умеренном климате. Азоспириллы, в основном колонизируют поверхность корня, и лишь некоторые штаммы способны проникать во внутренние ткани корня (Steenhoudt, Vanderleyden, 2000; Saikia et al. , 2012). Вопросы, связанные с проникновением бактерий в ткани корня растений являются одними из невыясненных в исследовании азотфиксирующих бактериально-растительных ассоциаций.

Фитопатогенные и мутуалистические микроорганизмы, такие как Rhizobium и Azospirillum являются известными продуцентами ферментов деградирующих пектин клеточной стенки растений (Khammas et al., 1989). В тоже время показана способность ризобий за счет Nod фактора индуцировать активность этих ферментов в самой растительной клетке на начальных этапах взаимодействия (Xie et al., 2012).

С действием пектолитических ферментов связывают не только процессы разрушения пектиновых веществ при проникновении и продвижении по тканям растения, но и изменение проницаемости для воды и ионов. Повреждающее действие пектолитических ферментов вызывает сдвиг физиологических процессов и развитие в тканях растения ответных реакций, соотношение которых может определять исход взаимоотношений между организмами.

Как показано в большинстве случаев, пектинолитические ферменты растений, являются гликопротеинами и, следовательно, несут детерминанты специфичности (Albersheim, Valent, 1978). Присутствие в молекулах пектолитических ферментов углеводов (Cervone et al. , 1981) может обусловливать специфическое взаимодействие с лектинами, в том числе бактериальными.

Никитина с соавт. (1996) показала присутствие на поверхности клеток азоспирилл лектинов, вовлеченных в бактериальную адгезию к корням. С поверхности двух отличающихся по способу колонизации растений штаммов ассоциативных азотфиксирующих бактерий -A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp245 были изолированы лектины, являющиеся гликопротеинами с различными молекулярными массами и углеводной специфичностью (Никитина с соавт., 2005; Шелудько с соавт., 2009). Было показано, что лектины азоспирилл являются полифункциональными молекулами. Помимо адгезивной функции, они способны влиять на метаболизм растительной клетки - стимулировать прорастание семян (Никитина с соавт., 2004), проявлять по отношению к растительной клетке митогенную и ферментмодифицирующую активности (Alen’kina et al., 2006; Чернышева с соавт., 2005), изменять содержание стрессовых метаболитов в растительной клетке, что свидетельствует о способности лектинов выступать в качестве индукторов адаптационных процессов корней проростков пшеницы (Alen’kina et al., 2014).

В связи с вышесказанным, целью данной работы была сравнительная оценка способности лектинов A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp245 оказывать регулирующее воздействие на активность пектинолитических ферментов в корнях проростков пшеницы.

MATERIALS AND METHODS

В работе были использованы лектины двух штаммов бактерий рода Azospirillum – A. brasilense Sp7 (эпифитный) полученный из Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (г. Москва) и A. brasilense Sp245 (эндофитный) из коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАН. Выращивание культур, выделение и очистку лектинов проводили, как описано ранее (Никитина с соавт. , 1996; Шелудько с соавт. , 2009).

В работе использовали 3-х суточные проростки пшеницы Саратовская 29. Корни после экспозиции с препаратами лектинов (концентрации лектинов 5-40 мкг/мл, максимальное время инкубации – 1 ч), гомогенизировали в 0.15 М фосфатном буфере (рН 7.8). Гомогенат центрифугировали при 7000g, надосадочную жидкость использовали для определения активности ферментов.

Активность полигалактуроназы, пектатлиазы и пектинэстеразы определяли по описанной методике (Ермаков с соавт. , 1987). Активность ферментов выражали числом единиц активности фермента в 1 г сырой массы корней.

Полученные результаты подвергали статистической обработке. Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости.

RESULTS AND DISCUSSION

Результаты проведенных исследований показали, что изучаемые лектины в концентрациях от 5 до 20 мкг/мл после 1ч воздействия на корни проростков пшеницы способны вызывать индукцию активности полигалактуроназы, пектинэстеразы, пектатлиазы -ферментов пектинолитического комплекса клеточной стенки растений. Самой эффективной оказалась концентрация обоих лектинов 10 мкг/мл. Наибольший эффект наблюдался по отношению к полигалактуроназе, увеличение активности для лектинов A. brasilense Sp7 и Sp245 составляло 80 и 150%, соответственно. Несколько меньшим оказалось влияние лектинов на активность пектатлиазы. В данном случае увеличение активности составило 50% для лектина A. brasilense Sp7 и 100% для лектина A. brasilense Sp245. Самым незначительным было влияние лектинов на активность пектинэстеразы. Лектин эпифитного штамма вызывал увеличение активности фермента на 10%, эндофитного штамма на 50%. Результаты продемонстрировали наиболее высокую индуцирующую активность лектина эндофитного штамма Sp245 по отношению ко всем изучаемым ферментам, что по-видимому связано со способностью данного штамма проникать внутрь корня.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что лектины азоспирилл способны вызывать индукцию пектинразрушающих ферментов самих растений, являющихся одним из основных факторов, способствующих разрушению клеточных стенок и внедрению микроорганизмов в ткани растения и в этом прослеживается сходство с бобово-ризобиальным симбиозом (Xie et al., 2012).

Figure 1. Влияние лектинов A. brasilense Sp7 и Sp245 на активность пектолитических ферментов корней проростков пшеницы. Контроль-корни: активность пектатлиазы – 20 ед/г сырой массы, полигалактуроназы – 10 ед/г сырой массы, пектинэстеразы – 25 ед/г сырой массы. Концентрация лектинов – 10 мкг/мл. Время инкубации – 1ч.

Роль пектолитических ферментов не ограничена только процессами разрушения пектиновых веществ, происходящих при проникновении и продвижении микроорганизмов по тканям растения. Повреждающее действие пектолитических ферментов вызывает в клетке сдвиг физиологических процессов и развитие ответных реакций в тканях растения. Соотношение этих реакций, скорость и интенсивность могут определять исход взаимоотношений между организмами. Клеточная стенка растений рассматривается как "депо" ферментов: в ней обнаружен целый ряд ферментов, в том числе и пероксидазы. Показано, что пероксидазы локализованы в свободном пространстве клеточной стенки, а также связаны ионными или ковалентными связями (Mader et al.,1980; Sasaki et al., 2008). Многие исследователи наблюдали активирование и освобождение пероксидаз, локализованных в клеточных стенках, при действии пектолитических ферментов (Гладких и др., 1979). С действием пероксидаз связывают образование этилена (Lund, Mapson, 1970) и перекиси водорода (Bhattachrjee, 2005), оказывающих токсическое действие на ткани растения, окисление индолилуксусной кислоты (ИУК), изменяющее гормональный баланс в клетках (Cheng, Song, 2006). Полагают, что растворенные и активированные пероксидазы, связанные с клеточными стенками, вызывают в клетках хозяина развитие метаболических изменений, нарушающих скоординированные физиологические процессы в клетках.

Вероятно, вышесказанное объясняет тот факт, что лектин A. brasilense Sp7, штамма, не обладающего способностью проникать в ткани растения, также как и лектин A. brasilense Sp245 (эндофитного штамма) способен вызывать, хотя и в меньшей степени, индукцию пектолитических ферментов растительной клетки.

Полученные результаты и предыдущие данные, свидетельствующие о способности лектинов азоспирилл вызывать спектр ответных биохимических реакций, являющихся частью сигнальных систем (Alen’kina et al. , 2014), дают основания полагать, что лектины азоспирилл могут индуцировать развитие ответных реакций в растениях, что в сочетании с ростстимулирующим эффектом бактерий способствует формированию устойчивости и продуктивности растений.