Активность трипсина в молоке коров повышается при маститах одновременно с экспрессией генов воспаления

Мастит (воспаление молочной железы) — одно из наиболее распространенных заболеваний молочного скота. Патология вызывает экономические потери из-за снижения надоев и плохого качества молока (1-3). Для борьбы с маститом коров и уменьшения ущерба, наносимого этим заболеванием, ведется поиск более совершенных и высокочувствительных методов диагностики и лечения болезни (4).

В проводимых исследованиях большое внимание закономерно уделяется морфологическому и биохимическому анализу крови (5, 6), но надежность получаемых показателей в качестве прогностических не доказана (6).

Еще одно современное направление — оценка экспрессии генов, ассоциированных с воспалением (7-9). Но и в этом случае результаты вне связи с другими показателями пока что не рассматриваются как однозначные (8).

Известно, что в крови животных и человека присутствуют активные пищеварительные ферменты (10-12). Возможность проникновения ферментов в кровь благодаря особенностям в строении клеток поджелудочной железы описана советскими учеными еще в 1973 году (13). Ферменты крови рассматривают в качестве возможных маркеров при диагностике маститов у коров (14). К таким индикаторам следует отнести N-ацетил-бета-D-глюко-заминидазу, лактозу, гаптоглобин и сывороточный амилоид А молока коров (15). Ранее было показано, что только тест на активность щелочной фосфатазы надежен при ранней диагностике субклинического мастита коров, но не тесты по лактатдегидрогеназе и аспартатаминотрансферазе (15).

Часть ферментов попадает в молоко в результате синтеза в клетках молочной железы, некоторые ферменты продуцируются различными микроорганизмами, находящимися в молоке, которые в процессе жизнедеятельности выделяют вещества, изменяющие состав и свойства молока. В женском молоке обнаружена липаза, лактаза, фосфатаза, редуктаза, пероксидаза, каталаза, трипсин, трипсиноген, лизоцим (14). В научной литературе имеются сведения по сравнительному анализу активности ферментов в грудном и коровьем молоке, а также показателей в человеческом молозиве и обычным молоке (15). Представлены доказательства в поддержку мнения о том, что липаза и рибонуклеаза, вероятно, попадают в молоко из крови; лизоцим выделяется из секреторных эпителиальных клеток; лактат и малатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и лактозосинтетаза синтезируются в молочной железе; липаза, диастаза, протеаза и лизоцим, стимулируемые солями желчных кислот, присутствуют в количествах, достаточных для расщепления субстратов молока (15). Изучается активность липазы в женском молоке (16).

Среди ферментов детального внимания, по нашему мнению, заслуживает трипсин, который рассматривают в качестве гормоноподобного вещества (17). Трипсин влияет на метаболизм и, как мы полагаем, способен быть маркером в диагностике воспалительных процессов в организме животных и человека (18). Ранее мы выявили изменения активности трипсина при экспериментальном токсикозе кур (19) и в зависимости от рационов (20). Несмотря на то, что транскриптомные ответы клеток молочной железы крупного рогатого скота на патогены, вызывающие мастит, были изучены (8), до сих пор неизвестна связь таких признаков мастита, как число соматических клеток в молоке и уровень экспрессии генов иммунитета, ассоциированных с воспалением молочной железы.

В настоящей работе впервые обнаружена активность трипсина в молоке коров, установлено ее изменение при мастите. Получены новые данные об экспрессии генов воспаления при мастите коров. Так, транскрипционная активность генов моноцитарного хемотаксического протеина 1 повышалась в 5,5 раза, моноцитарного хемотаксического протеина 2 — 9-кратно, фактора некроза опухоли — в 3,9 раза, генов интерлейкина 4 и интерлейкина 8 — в 2,9 раза и 14-кратно. Обсуждается возможность использовать активность трипсина как индикатора состояния молочной железы.

Целью работы было выявление активности трипсина в молоке здоровых и больных маститом коров и ее сопоставление с числом соматических клеток, относительной экспрессией генов воспаления, а также морфо-биохимическими показателями крови у животных.

Кровь брали из хвостовой вены в вакуумные пробирки для взятия венозной крови с активатором свертывания (наполнитель оксид кремния SiO 2 ). Для получения сравнимых результатов активность трипсина в сыворотке крови определяли так же, как в молоке (биохимический анализатор SINNOWA 3000M, «SINNOWA Medical Science & Technology Co., Ltd», Китай) (22). Биохимические показатели крови исследовали с помощью автоматического биохимического анализатора BioChem FC-120 («High Technology, Inc.», США) с использованием наборов реактивов для определения общего белка, глюкозы, холестерина, кальция, фосфора, щелочной фосфатазы («High Technology, Inc.», США).

Морфологию крови изучали на автоматическом гематологическом анализаторе MicroCC-20Plus («High Technology, Inc.», США). Анализ крови выполняли у здоровых и больных маститом коров (у каждой не менее 2 раз).

Анализ экспрессии генов проводили с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, reverse transcription polymerase chain reaction). Для этого отбирали образцы молока от 6 коров (¹¹ 1-3 — клинически здоровые животные, ¹¹ 4-6 — животные с признаками мастита; отбирали по пробе из каждой доли вымени, всего 24 образца). Образцы стабилизовали в растворе IntactRNA (ЗАО «Евроген», Россия) согласно рекомендациям производителя и хранили при температуре -20 °С.

Образцы гомогенизировали (гомогенизатор Precellys Evolution, «Bertin Technologies», Франция). Тотальную РНК из образцов выделяли с помощью набора Aurum Total RNA («Bio-Rad», США) согласно инструкции производителя. При помощи набора iScript™ Reverse Transcription Supermix («Bio-Rad», США) осуществляли реакцию обратной транскипции для получения кДНК на матрице РНК. Реакцию амплификации генов проводили с праймерами (23) при помощи набора SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix («BioRad», США) в соответствии с протоколом производителя (24) (амплификатор детектирующий ДТлайт, НПО «ДНК-Технология», Россия). Режим и условия амплификации при анализе были следующими:

5 мин при 95 °°С (предварительная денатурация); 30 с при 95 °С, 30 с при 60 °С, 30 с при 70 °С (40 циклов) (25). Относительную экспрессию определяли методом 2 - AA CT (26). В качестве референсного гена был выбран ген домашнего хозяйства RPL19 , кодирующий рибосомальный белок L19 (RPL19).

Статистическая обработка результатов включала расчет среднего значения ( M ) и среднеквадратичного отклонения (±SD) с помощью программы Microsoft Excel. Достоверность различий оценивали по t -критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Корреляционный анализ выполняли по Пирсону с использованием компьютерной программы Microsoft Excel.

Результаты . Для исследования отобрали коров с клиническими признаками мастита, дополнительно подтвержденными кенотестом и вискозиметрией. Контролем служили здоровые животные без признаков мастита.

Значения SSC и DSSC используются в качестве биомаркеров при мониторинге состояния молочной железы. Мы определили эти показатели в молоке здоровых и больных маститом коров, использовав метод проточной цитометрии.

1. Общее число соматических клеток и доля лимфоцитов и полиморфноядерных нейтрофилов в молоке здоровых (I группа) и больных маститом (II группа) коров ( Bos taurus ) Айрширской породы (ферма СГЦ «Смена» — филиала ФНЦ ВНИТИП РАН, Московская обл., 2022 год)

Показатель	I группа ( n = 10)	II группа ( n = 15)	t d	p
	M ±SD     Cv , %	M ±SD    Cv , %

Число соматических клеток, ½103/мл        176,6±53,4     82,4   584,9±122,7  286,9    3,05  0,0089

Доля лимфоцитов и полиморфноядерных нейтрофилов в общей сумме клеток, %       49,8±2,8      11,3    76,8±6,4     14,8    3,87  0,0046

Примечание. Общее число исследованных образцов в I группе не менее 20, во второй — не менее 30.

В нашем опыте в молоке здоровых коров число соматических клеток (SCC) составило 176,6½10³/мл, что в 3,31 раза меньше (p < 0,01), чем в молоке больных маститом животных. Размах фенотипической изменчивости ( Cv , %) свидетельствует о значительно меньшей вариабельности этого показателя в молоке здоровых животных. Показатель DSCC в молоке здоровых животных составил 49,8 %, тогда как в молоке больных — 76,8 %, или в 1,54 раза больше. Разница между сравниваемыми группами была высокодостоверной (p < 0,01). Обращает на себя внимание тот факт, что в сравниваемых группах размах фенотипической изменчивости по DSCC был близким. Следовательно, этот показатель более стабилен, чем общее число соматических клеток в молоке.

• 2.    Активность трипсина в сыворотке крови и молоке у здоровых (I группа) и больных маститом (II группа) коров ( Bos taurus ) Айрширской породы ( M ±SD; ферма СГЦ «Смена» — филиала ФНЦ ВНИТИП РАН, Московская обл., 2022 год)

Показатель             I группа ( n = 10)                     II группа ( n = 15)

М олоко (по долям вымени)

Активность, ед/л     ЛП     ЛЗ      ПЗ     ПП      ЛП      ЛЗ      ПЗ      ПП

51,0±10,3 51,0±7,7  47,0±6,2  44,0±6,5 111,0±18,3 76,0±11,5 82,0±12,1 130,0±14,5

В среднем                       48,2±3,8                                99,6±7,3*

Коэффициент ЗМЖ    1,1       1,1       1,2       1,3       0,5        0,7       0,6        0,4

В среднем                         1,20                                     0,55

Сыворотка крови

Активность, ед/л                   57,9±2,5                                 52,4±3,1

Примечани е. ЗМЖ — коэффициент здоровья молочной железы, ЛП — левая передняя доля вымени, ЛЗ — левая задняя доля вымени, ПЗ — правая задняя доля вымени, ПП — правая передняя доля вымени. Образцы от каждого животного отбирали дважды.

* Различия с I группой статистически значимы при p < 0,05.

Мы выявили активность трипсина как в сыворотке крови, так и в молоке коров (табл. 1). В пределах выборки активность этого фермента оказалась стабильным показателем. Для оценки здоровья молочной железы мы предлагаем следующую формулу: ЗМЖ = ТК/ТМ, где ЗМЖ — коэффициент здоровья молочной железы; ТК — активность трипсина в крови, ед/л; ТМ — активность трипсина в молоке, ед/л. При ЗМЖ = 1,1 и выше состояние молочной железы следует считать нормальным, при ЗМЖ < 1,1 происходит отклонение от нормы, вызванное воспалительной реакцией в молочной железе.

Результаты показали, что по активности трипсина сыворотка крови здоровых и больных маститом коров не имела существенных различий. Активность трипсина в молоке четко соответствовала состоянию здоровья молочной железы, колебания значений от средней величины в выборке были обусловлены наличием в пробе молочного жира. Так, у больных маститом коров активность трипсина в молоке возрастала на 106,6 % (p < 0,05) по сравнению с показателями у здоровых животных.

Анализ корреляции между показателями активности трипсина в молоке и сыворотке крови у коров показал, что у здоровых животных эта связь устойчивая средняя положительная ( r = 0,43; p < 0,05), а при патологии молочной железы переходила в среднюю отрицательную ( r = -0,45; p < 0,05). Поэтому в практике животноводства для диагностики ранней стадии мастита может быть предложен коэффициент оценки здоровья молочной железы (ЗМЖ), состоящий из двух взаимосвязанных показателей, который рассчитывается, как отношение активности трипсина в сыворотке крови к активности трипсина в свежей пробе полученного от животного молока в соответствии с формулой, приведенной выше.

Для оценки общего состояния здоровья животных были выполнены биохимические исследования крови (табл. 3).

3. Биохимические показатели крови у здоровых (I группа) и больных маститом (II группа) коров ( Bos taurus ) Айрширской породы ( M ±SD; ферма СГЦ «Смена» — филиала ФНЦ ВНИТИП РАН, Московская обл., 2022 год)

Показатель         1	I группа ( n = 10)	II группа ( n = 15)
Общий белок, г/л	102±5,2	92±1,9
Альбумины, г/л	52±4,2	62±3,2
Глюкоза, ммоль/л	2,2±0,14	3,7±0,12*
Холестерин, ммоль/л	3,6±0,65	4,0±0,28
Кальций, ммоль/л	2,2±0,06	2,5±0,07*
Фосфор, ммоль/л	2,1±0,18	1,6±0,13*
Щелочная фосфатаза, ед/л	249±12,7	180±30,9

Пр им еч ан и е. Общее число исследованных образцов в I группе не менее 20, во второй — не менее 30. ^∗ Различия с I группой статистически значимы при p < 0,05.

Наиболее информативными в этом случае оказались показатели по содержанию глюкозы, кальция и фосфора в сыворотке крови. Результаты показали, что в сыворотке крови больных маститом коров возрастает количество глюкозы на 67,4 % (p < 0,05), кальция – на 38,8 % (p < 0,05), содержание фосфора, наоборот, снижается на 23,8 % (p < 0,05) по сравнению со здоровыми животными.

Для оценки иммунного статуса животных были выполнены исследования морфологических показателей крови (табл. 4).

• 4.    Гематологические показатели у здоровых (I группа) и больных маститом (II группа) коров ( Bos taurus ) Айрширской породы ( M ±SD; ферма СГЦ «Смена» — филиала ФНЦ ВНИТИП РАН, Московская обл., 2022 год)

• 5.    Относительная экспрессия генов в молоке здоровых (I группа) и больных маститом (II группа) коров ( Bos taurus ) Айрширской породы ( M ±SD; ферма СГЦ «Смена» — филиала ФНЦ ВНИТИП РАН, Московская обл., 2022 год)

Показатель           I I группа ( n = 10)             II группа ( n = 15)

Лейкоциты (WBC), ½10⁹/л                   5,0±0,42                        9,6±0,93 ∗

Нейтрофилы (Neu), %                       43,4±3,51                       49,5±6,78

		Продолжение таблицы 4
Лимфоциты (Lym), %	44,9±1,30	40,7±4,60
Моноциты (Mon), %	4,3±0,40	6,3±0,83 ∗
Эозинофилы (Eos), %	6,8±0,53	2,9±0,18 ∗
Базофилы (Bas), %	0,6±0,06	0,4±0,04 ∗
Эритроциты (RBC), ½1012/л	5,5±0,09	5,4±0,12
Концентрация гемоглобина (HGB), г/л	91,0±0,51	85,0±1,22 ∗
Гематокрит (HCT), %	26,6±0,25	25,0±0,38 ∗
Пр и м еч ани е. Общее число исследованных образцов в I группе не менее 20, во второй — не менее 30.
∗ Различия с I группой статистически значимы при p < 0,05.

Данные таблицы показывают, что число лейкоцитов в крови коров при маститах увеличивается на 92,0 % (p < 0,05). Для определения уровня стресса за основу использовали индекс Гаркави (27), рассчитанный, как отношение относительного содержания лимфоцитов к относительному содержанию нейтрофилов. Несмотря на то, что процентное содержание нейтрофилов и лимфоцитов находятся в пределах физиологических норм, рассчитанный индекс указывает на наличие стресса у животных. Так, у здоровых коров показатель равен 1,03, у коров с признаками мастита – 0,82. Снижение коэффициента связано с уменьшением числа лимфоцитов на 9,4 %. При расчете индекса иммунореактивности (ИИР) по Д.О. Иванову (2014) по формуле ИИР = (Л +Э)/М, где Л — лимфоциты, Э — эозинофилы, М — моноциты (28), установлено, что этот показатель при маститах снижается на 42,5 % . При воспалении молочной железы мы отмечали снижение числа эозинофилов (на 57,4 %; p < 0,05), моноцитов (на 31,5 %; p < 0,05) и базофилов (на 33,3 %; p < 0,05).

Процессы окисления в организме коров при маститах происходят менее интенсивно за счет уменьшения количества гемоглобина, переносящего кислород клеткам, на 6,6 % (p < 0,05). В группе больных маститом животных гематокрит снижался на 6,0 % (p < 0,05) по сравнению со здоровыми, что также негативно влияет на метаболизм.

Группа       1 MCP-1  MCP-2 ]  TNF- α □ INF- γ □ IL2 ]  IL4     IL8 I Casp6

I ( n = 3)                          1            1            1            1        –        1            1          –

II ( n = 3)                 5,48±0,68  9,17±0,67  3,85±0,51  0,72±0,33  –  2,85±0,26 14,17±1,60    –

Пр и м еч ани е. Отбирали по пробе молока из каждой доли вымени, всего 24 образца в эксперименте. Прочерки означают, что экспрессию генов не выявили.

При сравнении экспрессии генов MCP-1, MCP-2, TNF-α, INF-γ, IL2, IL4, IL8, Casp6 у здоровых и больных маститом коров мы выявили повышение транскрипционной активности практически всех генов, связанных с развитием воспалений. Известно, что воспаление может быть результатом взаимодействия нескольких путей регуляции или биологических процессов (29). Однако в настоящее время знаний об экспрессии воспалительных и регуляторных цитокинов в клетках, содержащихся в молоке коров, недостаточно. Предыдущие исследования показали, что провоспалительные цитокины нередко рассматриваются в качестве перспективных биомаркеров мастита, в том числе специфичных для определения статуса и этиологии заболевания (8). В частности, сообщалось, что на ранних стадиях развития мастита уровень воспалительных цитокинов увеличивается быстрее, чем общее число соматических клеток в молоке (9). При этом продемонстрировано, что использование количества соматических клеток в молоке в качестве селекционного признака для повышения устойчивости к маститу у крупного рогатого скота дало ограниченные результаты (30), поэтому ин- формация о молекулярных маркерах восприимчивости/резистентности к маститу считается перспективной для выявления генетически устойчивого к маститу крупного рогатого скота (31-33).

Этиологию маститов, помимо механических повреждений во время доения, довольно часто связывает с возникновением различных инфекций, которые влияют на организм хозяина на ранних стадиях заболевания, вызывая, в частности, секрецию цитокинов. При этом продукция разных цитокинов в ответ на различные инфекции неодинакова, что может служить дифференцирующим фактором этиологии маститов (34-36). Так, наиболее часто развитие маститов связывают с бактериальными инфекциями, однако в качестве возбудителей могут выступать вирусы, микроскопические водоросли и грибы (37-40). В частности, сообщалось, что водоросли рода Prototheca являются третьим по распространенности возбудителем мастита после представителей родов Streptococcus и Staphylococcus (41).

Эпителиальные клетки внутренних протоков молочной железы играют ключевую роль в распознавании патогенов, вызывающих мастит, благодаря toll-подобным рецепторам (TLR2 и TLR4) (42, 43). TLR оказывают влияние на транскрипционный фактор NF- κ B, который контролирует экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла, в частности генов фактора некроза опухоли α (TNF-α) и интерлейкинов IL1β, IL6 и IL8 (44-46). Хорошо известно, что цитокины сыворотки крови, такие как интерферон, фактор некроза опухоли α, IL17, IL6 и IL4, играют ключевую роль в воспалительных процессах, что предполагает их возможное участие в патологическом процессе при маститах у крупного рогатого скота (47, 48).

Цитокины имеют важное значение для межклеточной коммуникации. Среди известных процессов, которые стимулируются или ингибируются цитокинами, — клеточная дифференцировка, пролиферация, ремоделирование, дегенерация, регенерация и даже гибель клеток. Сообщалось, что при мастите наряду с увеличением количества соматических клеток повышается уровень секретируемых цитокинов (интерлейкинов IL1, IL2, IL4, IL5, IL6, IL8, IL10 и IL12) в молоке (49).

В нашем исследовании (см. табл. 5) у коров, больных маститом, произошло увеличение экспрессии моноцитарного хемотаксического протеина 1 и моноцитарного хемотаксического протеина 2. Это цитокины, относящиеся к группе CC-хемокинов. Экспрессия МСР-1 увеличилась у больных коров в 5,5 раза, МСР-2 — в 9 раз. Моноцитам принадлежит ведущая роль в процессах воспаления. Накопление моноцитов обусловлено их адгезией и миграцией под влиянием хемоаттрактантов, в частности недавно описанных хемотактических цитокинов (хемокинов) (50, 51). Специфический для моноцитов хемокин МСР-1 (monocyte chemoattractant protein 1) синтезируется активированными моноцитами/макрофагами и клетками сосудистой стенки и, связываясь со своим рецептором CCR2, регулирует адгезию и миграцию моноцитов на матриксных белках и эндотелии. MCP-2 обладает уникальными функциональными свойствами по сравнению с другими хемокинами, в том числе с MCP-1. Другие научные группы при моделировании мастита in vitro показали, что эпителиальные клетки молочной железы крупного рогатого скота могут экспрессировать хемокины CXCL6 (также называемый GCP2) и CCL8 (также называемый MCP2) в ответ на определенные компоненты бактериальных клеток (52, 53). В целом же экспрессия моноцитарного хемотаксического протеина 1 и моноцитарного хемотаксического протеина 2 при маститах мало изучена, поэтому полученные нами данные представляют значительный интерес в связи с обсуждаемой проблематикой.

Экспрессия фактора некроза опухоли α у больных маститом коров по сравнению со здоровыми возросла в 3,9 раза (см. табл. 5). Фактор некроза опухоли TNF-α представляет собой провоспалительный цитокин, вырабатываемый преимущественно макрофагами. В зависимости от локализации его высвобождения и рецептора, с которым он будет связываться, TNF-α может выполнять различные функции, например стимулировать синтез других цитокинов и вызывать воспалительные реакции, контролировать жизненно важные процессы в клетке и поддерживать тканевой гомеостаз (54, 55). В связи с этим в сочетании с другими цитокинами TNF-α играет важную клиническую роль у крупного рогатого скота, опосредуя иммунные воспалительные реакции (мастит, эндотоксический шок, эндометрит). Сообщалось, что цитокины, в частности TNF-α, участвуют в развитии метаболических заболеваниях, например ацидоза (56). TNF-α вовлечен в возникновение воспалительного процесса (57), также регулирует ряд физиологических функций, включая аппетит, лихорадку, энергетический обмен и эндокринную активность (58). Такие агенты, как вирусы, паразиты, бактерии и эндотоксины, индуцируют продукцию TNF-α (59).

Также мы выявили, что уровень экспрессии интерлейкинов 4 и 8 у больных маститом коров повысился — соответственно в 2,9 раза и 14-кратно (см. табл. 5). Интерлейкины представляют собой полипептиды, продуцируемые клетками, участвующими в иммунных и воспалительных реакциях (60).

Главными продуцентами IL4 в молочных железах крупного рогатого скота служат Т- и В-лимфоциты, эозинофилы и базофилы, тучные клетки, плазматические клетки (60, 61), а также эпителиальные клетки, которые в совокупности составляют основу иммунного ответа II типа (62). Сообщалось, что IL4 регулирует врожденный иммунитет и оказывает ингибирующее действие на интерферон IFN-γ у молочных коров (60). В нашем исследовании вместе с повышением экспрессии IL4 мы отметили тенденцию к повышению экспрессии IFN-γ — цитокина, секретируемого различными клетками, участвующими в реакциях врожденного и адаптивного иммунитета (63), а также антигенпрезентирующими клетками, вовлеченными в элиминацию возбудителей (64, 65). Интересно, что в других исследованиях содержание IL4 в молоке при маститах, напротив, снижалось (66), следовательно, этот вопрос требует дальнейшего изучения.

Интерлейкин 8 (IL8) (67) представляет собой воспалительный цитокин, который продуцируется различными типами клеток — лимфоцитами, нейтрофилами, моноцитами, макрофагами и эпителиальными клетками (68), включая эпителиальные клетки молочной железы крупного рогатого скота (69). В месте воспаления IL8 участвует в привлечении и активации нейтрофилов (70). Во время острой фазы колиформного мастита концентрация IL8 в молоке коров значительно увеличивается (71). Хемотаксическая активность IL8 обнаружена в секрете молочной железы коров с маститами при интрамаммарной инфекции Staphylococcus aureus , но не обнаружена у здоровых коров (72). В связи с этим считается, что интерлейкин 8 участвует в инфильтрации нейтрофилов в секрет молочной железы во время мастита. Также предполагают, что интерлейкин 8 участвует в изменениях белкового состава молока посредством подавления секреции специфического для молока белка и притока сывороточных белков (72). В целом, IL8 считается мощным медиатором воспаления, а также участвует в привлечении лейкоцитов к местам инфекции (73). В связи с развитием мастита изучаются полиморфизмы гена IL8 (74, 75). При этом сообщалось, что один из полиморфизмов — +472 A>G в IL8 связан с высоким числом соматических клеток в молоке коров, инфицированных S. aureus (76)

Поскольку активность трипсина в крови связана с содержанием метаболитов оксида азота (77), есть вероятность участия трипсина в воспалительной реакции в ткани молочной железы. Тем более, что существует способ диагностики мастита по содержанию нитрита (NO2-) и нитрозотиолов (RSNO) в молоке (4). Метод определения этих соединений в биологических объектах широко представлен в литературе (78). Полученные данные позволяют заключить, что трипсин в организме является не только ферментом поджелудочной железы, но и сигнальной молекулой, которая вовлечена в процессы метаболизма и поддержания здоровья органов и тканей.

Также открыты рецепторы (PAR2), которые активируются трипсином (80). Трипсин является основной протеазой, активирующей PAR2, которая инициирует передачу сигналов при воспалении (81). Рецептор PAR2 локализуется на апикальной и базолатеральной мембранах клеток эпителия кишечника (82, 83) и может стимулироваться трипсином, триптазой и бактериальными протеазами (84). PAR2 также присутствует в мембране клеток иммунной системы, стромальных и эндотелиальных клеток. Системно стимуляция PAR2 способствует свертыванию крови, адгезии и экстравазации лейкоцитов (85). Таким образом, можно предположить, что повышение активности трипсина в молоке и крови больных маститом коров связано с активацией рецепторов PAR2 в эпителиальных клетках молочной железы и лейкоцитах крови.

В представленной работе нами впервые выявлена активность трипсина в молоке здоровых коров и отмечено ее значительное повышение при мастите, что указывает на связь трипсина с воспалительной реакцией в молочной железе. Ранее мы изучили роль трипсина при экспериментальном токсикозе кур (19) и изменении рационов (20). В специальной литературе отмечается множественность локализации (80) и функций трипсина (84, 85), в том числе как элемента сигнальной системы (17). Таким образом, активность трипсина можно рассматривать в качестве маркера нарушений гомеостаза. Связь активности трипсина в молоке с маститом и его физиологобиохимическими проявлениями ранее не исследовалась.

Мы дополнительно выполнили биохимический и морфологический анализ крови и определили в пробах молока SCC, DSCC и уровень экспрессии основных генов иммунитета. Оказалось, что у больных маститом коров, наряду с 2-кратным повышением активности трипсина, кратно возросли показатели SCC, DSCC и экспрессия генов MCP-1, MCP-2, TNF-α, IL4 и IL8. Выявленные кратные увеличения активности трипсина и генной экспрессии дают основания полагать, что, сочетая эти показатели, можно разработать тест, чувствительность которого будет достаточной для ранней диагностики субклинических форм мастита и предмаститных состояний. Сравнение этих показателей в динамике, начиная с предмаститных со- стояний, и при маститах разной этиологии даст новые знания о механизмах развития и течения этой патологии. На следующем этапе исследований мы также планируем определить экспрессию гена трипсина у коров в норме и при маститах.

Итак, результаты выполненного нами исследования позволяют сделать следующие выводы. У здоровых коров в молоке впервые обнаружен фермент трипсин, активность которого составляет 48,2±3,8 ед/л, что сопоставимо с показателем в сыворотке крови. При воспалении молочной железы, которое сопровождалось увеличением числа соматических клеток (somatic cell count, SCC) в молоке в 3,3 раза (p < 0,01) по сравнению с молоком здоровых животных, активность трипсина повышалась в 2,0 раза. В крови коров, больных маститом, количество глюкозы было выше на 67,4 % (p < 0,05), общего кальция — на 38,8 % (p < 0,05), содержание фосфора — наоборот, ниже на 23,8 % (p < 0,05), чем у здоровых животных, то есть по этим биохимическим показателям крови реакция организма на развитие патологии оказалась существенно ниже, чем по SCC и трипсину в молоке. Соотношение лимфоцитов и нейтрофилов у маститных коров снижалось на 20,4 %, иммунореактивность — на 42,5 %, количество эозинофилов — на 57,4 %, базофилов — на 33,3 %, количество моноцитов увеличивалось на 46,5 %, что также значительно ниже кратных изменений SCC и активности трипсина в молоке. У больных маститом коров по сравнению со здоровыми повысилась экспрессия связанных с воспалением генов моноцитарного хемотаксического протеина 1 (monocyte chemoattractant protein 1) в 5,5 раза, моноцитарного хемотаксического протеина 2 — 9-кратно, фактора некроза опухоли — в 3,9 раза, генов интерлейкина 4 и интерлейкина 8 — соответственно в 2,9 раза и 14-кратно. Выявленные большие различия по активности трипсина в молоке и экспрессии генов, ассоциированных с воспалениями, в норме и при мастите создают перспективу для разработки на этой основе диагностического теста, чувствительность которого будет достаточной для раннего выявления субклинических форм мастита и предмастит-ных состояний.