Альгинаты с различными молекулярными массами как сорбенты ионов кадмия и свинца

Загрязнение окружающей среды ионами тяжелых металлов представляет большую опасность для биосферы. Помимо непосредственного токсического действия на живые организмы тяжелые металлы имеют тенденцию к накоплению в пищевых цепях, что усиливает их опасность для человека [2, 10]. При поступлении в организм в токсических дозах с пищей, водой и вдыхаемым воздухом эти химические элементы приводят к развитию патологических изменений, затрагивающих все органы и системы [1, 5, 11]. В повседневной жизни люди редко задумываются о пагубном влиянии на состояние здоровья неблагоприятной экологической обстановки. Это связано со схожестью симптомов хронического отравления тяжелыми металлами и общего недомогания, вызванного стрессом и переутомлением. Поскольку выявить истинную причину недомогания бывает достаточно трудно, то, следовательно, профилактика подобных состояний представляется актуальной задачей.

В качестве перспективных соединений для профилактики отравлений тяжелыми металлами рассматриваются вещества природного происхождения (пектины, альгинаты, каррагинаны, фукоиданы) из группы пищевых волокон, необходимые организму для нормального функционирования пищеварительной системы и не обладающие побочными эффектами. В ряде научных работ была

Хотимченко Родион Юрьевич, аспирант доказана эффективность некрахмальных полисахаридов, как средств, способных связывать и выводить токсичные металлы из организма, такие как свинец, кадмий, ртуть [3, 6, 9, 12]. В этих работах применяли полисахариды с молекулярной массой более 40-50 кДа.

Цель работы: разработка методики получения низкомолекулярных альгинатов и проведение сравнительной оценки их связывающей активности в отношении ионов кадмия и свинца.

Материалы и методы. В качестве исходного сырья для получения альгинатов кальция различной молекулярной массы использовали коммерческий альгинат натрия («Aldrich»), содержание уроновых кислот в котором определяли спектрофотометрически с m-гидроксиди-фенилом [8]. Перед проведением гидролиза альгинат натрия переводили в кислотную форму путем реакции ионного обмена с 1 М раствором соляной кислоты. Полученную альгиновую кислоту суспендировали в 10-кратном избытке 0,5 М раствора соляной кислоты и проводили последующий гидролиз при температуре 90±0,5°С при интенсивном перемешивании в течение 2 часов для удаления гетерогенных (нерегулярных) участков молекул. По окончании гидролиза смесь охлаждали и отделяли жидкую фазу от нерастворимого осадка альгиновой кислоты центрифугированием при 2000g в течение 30 мин. Полученный осадок очищали от низкомолекулярных продуктов гидролиза путем суспендирования в 5-кратном объеме 0,5 М раствора соляной кислоты и последующего центрифугирования. Для получения среднемолекулярного альгината кальция, осадок альгиновой кислоты подвергали повторному 2-часовому гидролизу по вышеописанной методике. Жидкую фазу отделяли центрифугированием и в дальнейшем использовали для получения низкомолекулярного альгината. Полученный осадок переводили в раствор путем нейтрализации 1 М раствором гидроксида аммония до рН 4,0-5,0. Затем пробу разводили до конечной концентрации олигоуронидов 1-2 мг/мл, добавляли натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) до конечной концентрации 0,005 М и пропускали через ультрафильтрационную мембрану Milli-pore из регенерированной целлюлозы с пределом пропускания 30 кДа при стабилизированном давлении 0,3 МПа. Объем раствора в ячейке доводили до первоначальной величины добавлением 0,005 М раствора ЭДТА (рН 4,0-5,0) и процесс фильтрации повторяли. Данную процедуру проводили трижды. Полученный фильтрат аналогичным образом очищали от низкомолекулярных фракций на ультрафильтрационной мембране с пределом пропускания 10 кДа.

Низкомолекулярный альгинат кальция получали из жидкой фазы гидролизата, оставшегося после отделения осадка. Жидкую фазу нейтрализовали раствором 1 М гидроксида аммония до рН 4,0-5,0 и подвергали последовательному фракционированию на ультрафильтрационных мембранах с пределами пропускания 10 кДа и 3 кДа, как описано выше. Для получения низкомолекулярного альгината использовали фракцию олигоуронида, прошедшую через мембрану 10 кДа и задержавшуюся на мембране 3 кДа. Из полученных фракций олигоурониды осаждали в виде кальциевых солей добавлением 1 М раствора хлорида кальция, высушивали при 80ºС и стандартизовали по молекулярной массе.

Для определения молекулярной массы низкомолекулярных и среднемолекулярных альгинатов использовали высокоэффективную эксклюзионную хроматографию. В работе использовали хроматографическую систему Shimadzu LC-20 AD с рефрактометрическим детектором RID-10A и светорассеивающим лазерным детектором ELSD-LTII. Разделение проводили в колонках с гидрофильным полимерным сорбентом Shodex Asahipak GS-320 7E. В качестве элюента использовали 50 мМ ацетатно-аммиачный буфер, скорость элюирования 0,7 мл/мин. Молекулярную массу высокомолекулярного альгината кальция определяли вискозиметрическим методом [4]. Для оценки сорбционных характеристик экспериментальных образцов изучали их металлсвязывающую активность в отношении катионов свинца и кадмия по следующей методике. В емкость, снабженную магнитной мешалкой, вносили рассчитанный объем 0,1 М раствора нитрата свинца или кадмия, соответствующий его концентрации в растворе от 50 до 1200 мг/л, 1 мл 0,1 М ацетатного буфера со значением рН 6,0 и 10 мл 0,25% суспензии исследуемого образца. По показаниям рН-метра корректировали значение рН среды добавлением 0,1 М растворов гидроксида натрия или азотной кислоты. Объем реакционной смеси доводили до 20 мл дистиллированной водой и инкубировали при постоянном перемешивании в течение 60 мин при температуре 22-24°С. Раствор, содержавший несвя-завшиеся ионы кадмия или свинца, отделяли фильтрованием через гидрофильный фильтр Omnipore с размером пор 5,0 мкм. Определение остаточного содержания металла в жидкой фазе проводили комплексонометрическим методом. Количество связавшегося металла вычисляли по формуле:

Q=V(Ci-Ce)/M, где Q – количество связавшегося с сорбентом металла, мг/г; V – объем раствора в инкубационной емкости, л; Ci – начальная концентрация металла в суспензии, мг/л; Ce – равновесная концентрация металла в суспензии, мг/л; М – масса экспериментального образца, г [7].

Изучение количественных параметров сорбции осуществляли с использованием математических моделей Лэнгмюра, Фрейндлиха и Брюне-Еммет-Теллера (БЭТ). По результатам пяти экспериментов рассчитывали константы Лэнгмюра (максимальная сорбционная емкость [q max ] и коэффициент аффинитета [b]), Фрейндлиха (коэффициент связывающей емкости [K F ] и коэффициент интенсивности сорбции [n]) и БЭТ (коэффициент максимальной сорбционной емкости [Q]). Для оценки релевантности (достоверности) использования моделей рассчитывали коэффициент аппроксимации (R²).

Рис. 1. Хроматограммы: а) альгинат кальция с молекулярно-массовым распределением 11,021,0 кДа; б) альгинат кальция с молекулярномассовым распределением 4,0-9,8 кДа

Результаты и обсуждение. Методом кислотного гидролиза получены экспериментальные образцы альгината кальция и стандартизованы по молекулярной массе с помощью ВЭЖХ. Молекулярно-массовое распределение низкомолекулярного альгината составило 4,0-9,8 кДа, среднемолекулярного – 11,0-21,0 кДа. Для высокомолекулярного альгината молекулярная масса определена виско-зиметрически и составила 403 кДа. Хроматограммы приведены на рис. 1. Также исходный высокомолекулярный альгинат был стандартизован по содержанию уроновых кислот – 77%. Сравнив коэффициенты аппроксимации математических моделей Лэнгмюра, Фрейндлиха и БЭТ, мы пришли к выводу, что более достоверной является модель

Лэнгмюра (R2>0,95). Модель Фрейндлиха позволяет вычислить сорбционные показатели с меньшей достоверностью (R2>0,90). Математическая модель БЭТ, описывающая многослойное связывание сорбатов однородными активными центрами сорбента, не применима для описания сорбции катионов кадмия и свинца альгинатами (R2<0,90).

Рис. 3. Изотерма сорбции свинца при рН 6,0: а) низкомолекулярный альгинат, б) среднемолекулярный альгинат, в) высокомолекулярный альгинат

Рис. 2. Изотерма сорбции кадмия при рН 6,0: а) низкомолекулярный альгинат, б) среднемолекулярный альгинат, в) высокомолекулярный альгинат

Таблица 1. Экспериментальные константы Лэнгмюра и Фрейндлиха для связывания свинца образцами альгината кальция при рН 6,0

Образцы	Модель Лэнгмюра			Модель Фрейндлиха
	q max , мг/г	b, л/мг	R2	K F , мг/г	n	R 2
высокомолекулярный альгинат Ca	612,64±7,70	0,099±0,0081	0,999	213,81±63,37	5,21±1,70	0,909
среднемолекулярный альгинат Ca	649,30±25,04	0,016±0,0031	0,995	53,39±12,59	2,39±0,28	0,962
низкомолекулярный альгинат Ca	732,56±22,23	0,029±0,0051	0,990	105,33±47,80	3,00±0,85	0,904

Таблица 2. Экспериментальные константы Лэнгмюра и Фрейндлиха для связывания кадмия образцами альгината кальция при рН 6,0

Образцы	Модель Лэнгмюра			Модель Фрейндлиха
	q max , мг/г	b, л/мг	R 2	K F , мг/г	n	R 2
высокомолекулярный альгинат Ca	177,75±10,71	0,0046±0,00073	0,985	3,55±0,56	1,77±0,083	0,972
среднемолекулярный альгинат Ca	279,98±18,11	0,0034±0,00050	0,979	2,69±0,43	1,48±0,059	0,960
низкомолекулярный альгинат Ca	374,07±16,18	0,018±0,0038	0,991	32,52±9,19	2,56±0,34	0,945

По результатам экспериментов были построены изотермы Лэнгмюра (рис. 2-3) и определены сорбционные показатели (табл. 1-2). Из полученных данных следует, что максимальная сорбционная емкость низкомолекулекулярный и среднемолекулярных альгинатов превосходят таковую высокомолекулярного альгината в отношении свинца в среднем в 1,20 и 1,13 раза, а для кадмия в среднем в

2,10 и 1,37 раза, соответственно (табл. 1-2). Коэффициент аффинитета солей альгината кальция к катионам исследуемых металлов в большинстве случаев уменьшается при снижении молекулярной массы сорбентов. Данное наблюдение можно объяснить зависимостью прочности ионного комплекса сорбент-сорбат от размера участков молекулы полимера, вовлеченных в формирование комплекса.

Соответственно, для крупных молекул длина таких участков и прочность образованных ионных комплексов больше, чем у модифицированных молекул, полученных в ходе гидролиза.

Выводы: низкомолекуляный и среднемолекулярные альгинаты, полученные методом химического гидролиза, характеризуются способностью прочно и эффективно связывать ионы свинца и кадмия. Связывающая активность альгинатов зависит от молекулярной массы. Низкомолекулярный альгинат кальция обладает большей сорбционной емкостью, чем высокомолекулярный и среднемолекулярный образцы. Стандартизованные по молекулярной массе альгинаты могут быть рекомендованы в качестве основы для получения новых фармакологически активных веществ, предназначенных для профилактики и лечения интоксикации тяжелыми металлами.