Алгоритм патогистологического исследования эндокринного аппарата поджелудочной железы при экспериментальном сахарном диабете

Несмотря на активное изучение сахарного диабета (СД) и разнообразие его экспериментальных моделей (аллоксановый, стрептозотоциновый, иммунозависимый и др.), до настоящего времени отсутствует единый подход к методам проведения гистологического исследования и интерпретации изменений, возникающих в поджелудочной железе лабораторных животных. Гетерогенность пусковых механизмов СД значительно затрудняет выявление ранних изменений в панкреатических островках. Для достоверного заключения о степени тяжести экспериментального СД необходимо проведение комплексного патогистологического исследования, включающего макроскопическое исследование, светооптическую микроскопию, иммуногистохимическое и электронно-микроскопическое исследование с последующей математической обработкой полученных результатов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Разработать алгоритм морфологического исследования, основанный на выявлении наиболее значимых патогистологических изменений в островках Лангерганса поджелудочной железы.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

При макроскопической оценке для лучшей визуализации ткани поджелудочной железы необходимо проведение предварительной фиксации в течение 30 с в смеси формалина с уксусной кислотой [5, 4], затем фиксацию продолжают в 4%-м растворе забуференного нейтрального формалина в течение 24—48 ч при комнатной температуре. Данный способ позволяет в дальнейшем использовать широкий спектр гистологических окрасок, в том числе проведение иммуногистохимического исследования. После фиксации осуществляется вырезка материала с соблюдением анатомического разделения железы на головку, тело и хвост (у грызунов — кишечный, желудочный и селезеночный отделы) [2]. В дальнейшем с парафиновых блоков изготавливаются серийные срезы толщиной от 3 до 5 мкм.

Для светооптической микроскопии используется рутинная окраска гематоксилином и эозином [3], с помощью которой оценивается общий план строения железы, наличие или отсутствие воспаления, повреждения и репарации клеток панкреатических островков. Для оценки степени склерозирования возможно использование окрасок по методу Ван Гизона или по Массону (предпочтительно). Незаслуженно забыт метод выявления секреторных гранул β-клеток с помощью красителя «Фенаф», основными преимуществами которого, по сравнению с иммуногистохимическими методами, являются его простота и низкая стоимость реактивов.

Для выявления α-, β-клеток (островковой и внеостровковой локализации), определения состава клеточного инфильтрата при воспалении, выявления механизмов клеточной гибели, оценки индекса пролиферативной активности предшествен- ников β-клеток [6] и выявления других патологических процессов необходимо применение методов иммуногистохимического исследования. Данный вид исследования выполняется по стандартным протоколам в соответствии с инструкциями фирм-производителей реактивов. Оценка результатов иммуногистохимической реакции осуществляется по интенсивности окраски с использованием полуколичественной шкалы (негативная, слабая, умеренная, выраженная).

Для проведения электронно-микроскопического исследования достаточно фиксировать фрагменты поджелудочной железы размером не более 1 мм3 в течение 12 ч в 4%-м растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в течение 2 ч в 1%-м растворе тетраокиси осмия на 0,1М какодилатном буфере (рН = 7,4) при температуре +4 °С. После промывки в растворе какодилатного буфера материал необходимо дегидратировать в спиртах возрастающей концентрации и залить в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы толщиной 50—90 нм после контрастирования в 2,5%-м растворе уранилацетата на 50°-м этаноле в течение 40 мин и 0,3%-м растворе цитрата свинца в течение 20 мин можно изучать в электронном микроскопе.

Проведение морфометрического анализа проводится по классическим методикам [1] и включает следующие показатели:

• -    относительный и абсолютный размер α- и β-эндокриноцитов;

• -    относительный и абсолютный размер ядер α- и β-эндокриноцитов;

• -    площадь (объемная доля) занимаемая α- и β-клетками по отношению к панкреатическому островку;

• -    площадь (объемная доля) островков Лангерганса по отношению к ткани поджелудочной железы;

• -    индекс пролиферативной активности, индекс апоптоза (процент иммунопозитивных клеток на 100 исследуемых клеток);

• -    площадь (объемная доля), диаметр секреторных гранул α-, β- и других эндокринных клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В многочисленных экспериментальных исследованиях, проведенных в ВМНЦ, полученные с помощью разработанного алгоритма данные о состоянии структуры эндокринного аппарата поджелудочной железы демонстрировали высокую степень корреляции с биохимическими показателями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, использование комплексной патогистологической оценки эндокринного аппарата поджелудочной железы в морфологических исследованиях по экспериментальному моделированию СД характеризуется высокой информативностью полученных данных.