Аллельные варианты генов у каратистов и самбистов с разной спортивной успешностью

В спортивной генетике большое внимание уделяется выявлению генетической предрасположенности спортсменов к успешной соревновательной деятельности [Рогозкин и др., 1999; Ахметов, 2009; Бондарева, Година, Спицын, 2010]. Результаты молекулярногенетических исследований в области спорта открыли новые возможности в разработке и применении диагностических комплексов, направленных на решение проблем медико-генетического отбора в спорте, а также на оптимизацию тренировочного процесса [Rankinen et al., 2004, 2006].

Генетические различия отмечены среди спортсменов разной квалификации, поскольку, чем больше благоприятных для спорта аллелей содержится в ге-

нотипе атлета, тем более высоких результатов он может достичь [Моссэ и др., 2017]. В нециклических видах спорта, в отличие от циклических, физические качества спортсменов проявляются в разном соотношении, без какого-либо преобладания одного из них [Рыбина, 2015].

Ген α-актина-3 ( ACTN3 ) локализован в длинном плече 11 хромосомы (11q13-q14). Этот ген кодирует синтезирующийся в быстрых мышечных волокнах белок альфа-актинин-3, который стабилизирует сократительный аппарат скелетных мышц и участвует в различных метаболических процессах. Дефицит α-актинина-3 в быстрых мышечных волокнах может снижать скоростно-силовые показатели физической работоспособности человека. Носители генотипа R/R способны достичь высоких результатов на средних дистанциях в таких видах спорта, где требуется сочетание скорости и силы [Johanson et al,, 2009].

Ген PPARG, кодирующий гамма-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом, локализован в коротком плече 3 хромосомы (3p25); он отвечает за процессы окисления жирных кислот, а также влияет на потребность мышечной ткани в глюкозе и ее чувствительность к инсулину [Дроздовская и др., 2012].

Наибольший интерес представляет Pro12Ala полиморфизм (rs1801282) гена PPARG, заключающийся в замене нуклеотида С на G, что приводит к замещению пролина на аланин в положении 12 изоформы PPARγ2. Данная мутация вызывает снижение активности гена PPARG, что приводит к подавлению липолиза в адипоцитах и увеличению утилизации глюкозы мышцами; при этом скоростно-силовые качества организма повышаются. Наличие аллеля Ala гена PPARG указывает на предрасположенность к скоростно-силовым видам спорта [Скорина, Врублевский, Врублевская, 2015].

Если генетическая предрасположенность к занятиям циклическими видами спорта исследована в той или иной степени [Ахметов, 2009], то этот аспект у спортсменов, занимающихся ациклическими видами спорта, такими как карате и самбо, практически не изучен. В связи с этим анализ геномных профилей спортсменов, занимающихся различными видами спортивных единоборств, требующих, как правило, максимальной скорости и силы, важен для выявления полиморфных вариантов генов у спортсменов, дос- тигших высоких результатов в ациклических видах спорта.

Цель исследования – выявление и анализ полиморфных вариантов генов, ассоциированных с развитием и проявлением скоростно-силовых физических качеств, у спортсменов с различной спортивной успешностью, занимающихся карате и самбо в двух спортивных школах г. Перми.

Материал и методы исследования

Материал

Для проведения молекулярно-генетического анализа произведен забор проб буккального эпителия у 98 человек, из которых 56 спортсменов, занимающихся карате в МБОУ ДОД «СДЮШОР по карате» г. Перми [Гаврикова, 2016] , и 42 самбиста из школы КГБУ ДО «СДЮСШОР по дзюдо и самбо» г. Перми, в возрасте от 9 до 20 лет. Спортсмены, имеющие спортивные разряды (50 чел.), были разделены на 2 группы: «Группа I» с высокой квалификацией и «Группа II» с низкой квалификацией. В первую группу были отобраны: один мастер спорта (МС), 11 кандидатов в мастера спорта (КМС) и 13 спортсменов со 2- и 3-м взрослыми разрядами – всего 25 спортсменов. Все лица мужского пола. Вторая группа включала 25 человек, имеющих 1-, 2- и 3-й юношеские разряды, все лица мужского пола. Все испытуемые дали письменное добровольное согласие на генотипирование. Забор буккального эпителия у спортсменов для генетического анализа проводили посредством соско-ба эпителиальных клеток ротовой полости одноразовыми цитологическими щетками. ДНК выделяли сорбентным методом с помощью набора «Проба ГС», изготовленного компанией «ДНК-Технология» (Россия).

Методы исследования

У спортсменов, занимающихся карате и самбо, изучены полиморфные варианты двух генов, ассоциированных с развитием и проявлением физического качества скорость/сила, такие как полиморфизм R577X гена AСTN3 и Pro12Ala гена PPARG . Праймеры для ПЦР (табл. 1) синтезированы в ЗАО «Синтол», Россия.

Таблица 1

Праймеры для амплификации полиморфных позиций двух генов, ассоциированных у спортсменов со скоростно-силовыми качествами

Ген / полиморфная позиция	Последовательность праймеров (прямой и обратный)	Источник
ACTN3/ R577X	5'-CTGTTGCCTGTGGTAAGTGGG-3' 5'-TGGTCACAGTATGCAGGAGGG-3'	Rasmussen, Anzick, Waters, 2014
PPARG/ Pro12→Ala	5'-GCCAATTCAAGCCCAGTC-3' 5'-GATATGTTTGCAGACAGTGTATCAGTGAAGGAATC GCTTTCCG-3'	Eynon et al., 2009
*R577X – полиморфная позиция гена ACTN3 ( альфа-актинин-3 ); Pro12Ala – полимор		ная позиция гена PPARG

( гамма-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом ).

Полиморфизм R577X гена ACTN3 определяли, применяя в ПЦР соответствующую программу амплификации: предварительная денатурация 95°С – 1 мин.; 35 циклов: 95°С – 1 мин., 58°C – 30 cек., 72°C – 40 cек.; заключительная элонгация 72°C – 1 мин. В результате ПЦР получаются ампликоны различной длины. Для выявления полиморфизма R577X продукт ПЦР дополнительно инкубировали вместе с эндонуклеазой рестрикции DdeI («Thermo Fisher Scientific», USA). Наличие двух фрагментов ДНК длиной 205 и 85 п.н. соответствует генотипу R/R, трех фрагментов ДНК (108, 97 и 90 п.н.) – гомозиготе X/X, четырех фрагментов ДНК (85, 97, 108 и 205 п.н.) – гетерозиготе R/X [Rasmussen, An-zick, Waters, 2014].

Исследование полиморфных вариантов гена PPARG проводили с использованием ПЦР, применяя программу амплификации: предварительная денатурация при 95^оС – 4 мин.; 35 циклов амплификации: 94^оС – 30 cек., 66°С – 1 мин., 72°С – 30 сек.; последний цикл элонгации 72^оС – 6 мин. Для разделения фрагментов ампликоны инкубировали совместно с эндонуклеазой рестрикции для PPARG – Bsh1236I («Thermo Fisher Scientific», USA). При наличии одного фрагмента ДНК длиной 257 п.н. проявлялся генотип Ala/Ala, двух фрагментов ДНК (223 и 34 п.н.) – гомозигота Pro/Pro, трех фрагментов ДНК (257, 223 и 34 п.н.) – гетерозигота Ala/Pro.

Продукты рестрикции полиморфных позиций генов ACTN3 и PPARG фракционировали при помощи электрофореза в 2%-ном агарозном геле с окраской бромистым этидием и фотографированием в системе гель-документации GelDoc XR («Bio-Rad», USA) в проходящем ультрафиолетовом свете. Определение длин фрагментов ДНК проводилось при помощи программы Quantity One 4.6.2 («Bio-Rad», USA) с использованием маркера молекулярной массы (500 bp +1.5 + 3 Кb DNA Ladder; ООО «СибЭнзим-М», г. Москва). ПЦР и электрофорезы повторяли не менее трех раз. Оценка генетической предрасположенности к скоростносиловым качествам на основании генного профиля проведена посредством расчета общего генетического балла, или ОГБ [Williams, Folland, 2008]. Сравнение частот генотипов выполняли с помощью критерия Фишера при p<0.05 в программе STATISTICA 6.0.

Результаты и их обсуждение

При определении полиморфизма R577X гена ACTN3 у спортсменов г. Перми, занимающихся карате и самбо, установлено, что частота аллелей R и Х в «Группе I» более успешных спортсменов составила 0.82 (аллель R) и 0.18 (аллель X), а в

«Группе II» с меньшей успешностью – 0.38 и 0.62 соответственно (табл. 2).

При сравнении генотипов спортсменов всех разрядов выявлено распределение частот аллельных вариантов изученных генных полиморфизмов. Так, генотип R/R гена ACTN3 , при котором наблюдается высокая функциональная активность α-актина-3, отмечен у 25 (50%) спортсменов. Генотип R/X, характеризующийся средней функциональной активностью α-актина-3, был обнаружен у 10 (20%) спортсменов. Самый же неблагоприятный генотип X/X, при котором α-актин-3 заменяется на α-актин-2, что приводит к снижению скоростно-силовых показателей физической работоспособности человека, выявлен у 15 (30%) спортсменов.

Помимо частот аллелей проанализировано и распределение генотипов в соответствии с группами классификации спортсменов (табл. 2). Частота более благоприятного для развития и проявления скоростно-силовых качеств генотипа R/R в I успешной группе спортсменов равнялась 0.76 (19 человек), гетерозиготы R/X – 0.12 (3 спортсмена). Менее благоприятный генотип X/X в этой группе минимален и отмечен с частотой 0.12 (3 единоборца). Во II группе спортсмены с благоприятным генотипом R/R были отмечены с частотой 0.24 (6 человек). Гетерозиготный же генотип R/X встречался с частотой 0.28 (7 спортсменов), а менее благоприятный генотип X/X был представлен в «Группе II» в 4 раза чаще (0.48, что соответствовало 12 единоборцам) по сравнению с «Группой I» (0.12, 3 спортсмена).

Анализ частот генотипов и аллелей гена ACTN3 у спортсменов I группы с более высокими спортивными разрядами по сравнению со II группой с низкими разрядами, показал значимые различия по благоприятному генотипу R/R (F оп : 3.30>1.96 при p=0.05), также значимые различия были подтверждены по генотипу X/X (F оп : 3.31>1.96 при p=0.05), при котором наблюдается низкая функциональная активность α-актина-3. Различия частоты генотипа R/X между группами разной квалификации были незначимы (табл. 2). Преобладание более благоприятного генотипа R/R у атлетов с высокой квалификацией было отмечено у спортсменов, занимающихся циклическими видами спорта [Скорина, Врублевский, Врублевская, 2015].

Анализ полиморфной позиции Pro12Ala гена PPARG у 25 спортсменов группы I выявил низкую частоту неблагоприятного аллеля Pro (0.14) и высокую частоту благоприятного аллеля Ala (0.86). В группе II у 25 спортсменов частота аллелей Ala составила (0.68), соответственно (табл. 2) частота аллеля Pro– (0.32) Генотип Ala/Ala был определен у 28 единоборцев, то есть Ala найден с максимальной частотой 0.56. Генотип Ala/Pro был выявлен у 21 спортсмена (частота 0.42); при данном генотипе наблюдается средняя мышечная активность. Генотип Pro/Pro гена PPARG выявлен у 1 человека, частота данного аллеля составила (0.02); при данном генотипе повышена чувствительность к инсулину в медленных и быстрых мышечных волокнах, но его анаболическое действие выражено слабо.

Таблица 2

Частоты аллелей и генотипов двух генов у спортсменов с разной квалификацией

Аллель или генотип	Группы спортивной квалификации		Частота в общей выборке	F оп < > F st
	Группа I	Группа II

Ген ACTN3

R	0.82	0.38	0.6	3.30>1.96
X	0.18	0.62	0.4	3.31>1.96
R/R	0.76 (19)	0.24 (6)	0.5 (25)	3.86>1.96
R/X	0.12 (3)	0.28 (7)	0.2 (10)	1.44<1.96
X/X	0.12 (3)	0.48 (12)	0.3 (15)	2.90>1.96

Ген PPARG

Pro	0.14	0.32	0.23	1.53<1.96
Ala	0.86	0.68	0.77	1.54<1.96
Ala/Ala	0.76 (19)	0.36 (9)	0.56 (28)	2.93>1.96
Ala/Pro	0.2 (5)	0.64 (16)	0.42 (21)	5.54>1.96
Pro/Pro	0.04 (1)	0 (0)	0.02 (1)	0.44<1.96

Примечания: R, X – аллели гена ACTN3 , R/R, R/X, X/X – генотипы гена ACTN3 ; Ala, Pro, – аллели гена PPARG, Ala/Ala, Ala/Pro, Pro/Pro – генотипы гена PPARG ; Группа I – спортсмены с высокими спортивными разрядами; Группа II – спортсмены с низкими спортивными разрядами; F оп – F-критерий Фишера. F st -критерий Фишера стандартный (при p=0.05); в скобках указано число спортсменов.

Частота благоприятного для проявления скоростно-силовых качеств генотипа Ala/Ala у спортсменов группы I, имеющих высокую квалификацию, составила 0.76 (19 единоборцев), гетерозиготы Ala/Pro – 0.20 (5 спортсменов), а менее благоприятного генотипа Pro/Pro – только лишь 0.04 (1 человек). Вместе с тем, частота благоприятного генотипа Ala/Ala во II группе с низкой квалификацией снизилась до 0.36 (9 человек), и напротив, увеличилась частота гетерозиготного генотипа Ala/Pro до 0.64 (16 единоборцев). Генотип Pro/Pro не был обнаружен у спортсменов II группы.

Анализ частот аллелей и генотипов гена PPARG у спортсменов I группы с высокой результативностью при сопоставлении с II группой с низкой результативностью констатировал значимые различия по генотипам Ala/Ala и Ala/Pro (F оп :2.93>1.96 и F оп :5.54>1.96 соответственно при p=0.05) между сравниваемыми группами (табл. 2). Значимые различия по частоте аллелей не были выявлены между группами спортсменов с разными разрядами Ala (F оп : 1.54<1.96 при p=0.05) и Pro(F оп :1.53<1.96 при p=0,05).

Таким образом, у группы спортсменов с более высокой квалификацией (Группа I) в сравнении с группой с невысокой квалификацией (Группа II) достоверно различаются частоты четырех генотипов: R/R и X/X гена ACTN3 , а также генотипы Ala/Ala и Ala/Pro гена PPARG.

У 98 обследованных спортсменов на основании полиморфизма двух генов, контролирующих про- явление скоростно-силовых качеств, определен интегральный показатель – ОГБ. Наивысший показатель (100 баллов) отмечен у трети обследованных спортсменов – 29 человек (частота 0.30). Высокий результат (ОГБ=75 баллов) выявлен у 31 спортсмена, что составляет также треть обследованных спортсменов (частота 0.32). Средний показатель предрасположенности к развитию скоростносиловых качеств (ОГБ=50 баллов) определен у пятой части обследованных (20 спортсменов, частота 0.20). Низкий ОГБ (25 баллов) выявлен у 18 (частота 0.18). Спортсменам с низким ОГБ рекомендуется невысокий темп тренировок. У обследованных спортсменов самый низкий показатель (ОГБ=0 баллов) не отмечен.

Заключение

У 98 спортсменов, занимающихся карате и самбо в двух спортивных школах г. Перми, изучен полиморфизм R577X гена ACTN3, а также полиморфизм Pro12→Ala гена PPARG, которые ассоциированы с проявлением и развитием скоростносиловых качеств. У группы высококвалифицированных спортсменов (Группа I) и группы низкоквалифицированных спортсменов (Группа II) достоверно различаются частоты четырех генотипов: R/R (Fоп:3.30>1.96) и X/X (Fоп:3.31>1.96) гена ACTN3, а также генотипы Ala/Ala (Fоп:2.93>1.96) и Ala/Pro (Fоп:5.54>1.96) гена PPARG. К тому же, благоприятные для развития скоростно-силовых качеств генотипы встречаются в группах с разной квалификацией с высокой частотой: 0.76 у генотипа R/R гена ACTN3 и опять же 0.76 у генотипа Ala/Ala гена PPARG.

Таким образом, установлено, что сочетания полиморфных вариантов генов ACTN3 и PPARG оказывают влияние на успешность спортсменов, занимающихся карате и самбо.

Одним из интегральных показателей генетической предрасположенности к развитию и проявлению физических качеств спортсменов, включая и скоростно-силовые качества, является общий генетический балл (ОГБ). Оценка генетической перспективности спортсменов, для успешности которых важны скоростно-силовые качества, показала, что высокие значения ОГБ (от 75 до 100 баллов) характерны для 60 из 98 обследованных спортсменов.

Итак, для достижения выдающихся результатов спортсменам необходимо обладать соответствующим генетическим потенциалом и правильно выстраивать тренировочный процесс. Вместе с тем, генетическая компонента – лишь одна из составляющих спортивного успеха. Вместе с ней важны морфометрические данные и функциональное состояние спортсмена [Дятлов и др., 2014], а также желание победить. Индивидуальные данные генотипирования могут играть роль при решении проблем медико-генетического отбора в спорте и для оптимизации тренировочного процесса [Кручин-ский, 2014].

Выражаем искреннюю благодарность за возможность выполнения молекулярно-генетического анализа тренерам, медицинским работникам, спортсменам из школ МБОУ ДОД «СДЮШОР по карате» и КГБУ ДО «СДЮСШОР по дзюдо и самбо» г. Перми.