Аллельный полиморфизм фрагмента гена кислой вакуолярной инвертазы Pain-1 у сортов и линий картофеля (Solanum tuberosum L.)

Питательная и технологическая ценность клубней картофеля определяется содержанием крахмала (1). У растений крахмал выполняет запасающую функцию, поскольку не создает в клетке повышенного осмотического давления, будучи химически инертным (в отличие от глюкозы и сахарозы) (2, 3). В то же время именно крахмал — «слабое звено» при хранении клубней, так как под воздействием низких температур в растительных тканях происходят существенные изменения в углеводном обмене (4), а именно активируются сахарозолитические ферменты. Это приводит к распаду крахмала на простые сахара (глюкозу и фруктозу), которые участвуют в подержании внутриклеточного осмотического давления, тем самым

^∗ В работе использовано оборудование ЦКП «Биоинженерия» (ФГУ ФИЦ Фундаментальные основы биотехнологии РАН, г. Москва). Исследование выполнено в рамках КПНИ «Развитие селекции и семеноводства картофеля».

увеличивая резистентность растений к низким температурам. При температуре ниже +3 °С включается защитная реакция клубней на переохлаждение и крахмал начинает интенсивно разлагаться, что сопровождается накоплением редуцирующих сахаров (холодовое осахаривание, cold-induced sweetening) (5, 6). В результате из-за ухудшения вкусовых качеств клубней картофеля изменяются их товарные характеристики (7, 8). Кроме того, при термической обработке (приготовление отварного картофеля или картофельных чипсов) редуцирующие сахара взаимодействуют со свободными аминокислотами, приводя к изменению цвета продукта и накоплению в нем канцерогена — акриламида (9-11) .

Поиск нуклеотидных и аминокислотных замен, ассоциированных с накоплением крахмала и сахаров в клубнях и отсутствием холодового осахаривания, имеет большое значение для селекционного процесса.

Небольшое семейство растительных инвертаз, к которым относятся апопластные, вакуолярные и цитоплазматические инвертазы, катализирует необратимый гидролиз сахарозы до глюкозы и фруктозы. Однозначно показано, что кислая вакуолярная инвертаза, кодируемая геном Pain-1 , играет основную роль в холодовом осахаривании клубней картофеля. Ингибирование гена Pain-1 снижает накопление редуцирующих сахаров при низких температурах (12-16). У картофеля ( Solanum tuberosum ) ген кислой ва-куолярной инвертазы идентифицирован, изучена его структура и экспрессия, а также найдены однонуклеотидные замены (SNPs), которые могут оказывать определяющее влияние на активность фермента (17, 18).

Ранее показано, что наибольшее количество полиморфных сайтов детектируется в С-терминальной области (5-й экзон—стоп-кодон), который достаточно хорошо изучен у зарубежных сортов, более того, в указанной области обнаружены SNPs, ассоциированные с количеством крахмала в клубнях (17, 19). Анализ полиморфизма этого участка у набора из 19 сортов картофеля выявил наличие девяти аллельных вариантов (20).

Поиск новых аллельных вариантов гена Pain-1 , обусловливающего хозяйственно значимые признаки у картофеля, и оценка частоты встречаемости таких вариантов представляется важным для оптимизации селекционного процесса (21-23).

В представленном исследовании на основании анализа нуклеотидного и аминокислотного полиморфизма выявлены 78 аллельных вариантов фрагмента гена кислой вакуолярной инвертазы Pain-1 у сортов и линий картофеля, которые ранее не были охарактеризованы по этому признаку, и показано наличие 42 SNPs, из которых 34 описаны впервые.

Целью работы был анализ С-терминальной области гена кислой вакуолярной инвертазы Pain-1 у 69 сортов и линий картофеля разного происхождения, которые в настоящее время используются в селекционных программах.

Методика . А ллельный полиморфизм фрагмента гена кислой вакуо-лярной инвертазы Pain-1 изучали у 69 образцов картофеля, включая 55 сортов отечественной и зарубежной селекции, а также у 14 линий, используемых в настоящее время в селекционных программах (Всероссийский НИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха). Клубни проращивали в теплице при световом и температурном режиме 8/16 ч и 16/22 °С (ночь/день) с интенсивностью освещения 10-12 кЛк. Отобранные образцы характеризовались разным содержанием крахмала в клубнях и неодинаковой устойчивостью к абиотическим факторам.

Выделение ядерной растительной ДНК проводили на основании протокола, предложенного К. Edwards с соавт. (1991) из свежих листьев согласно описанию (24). Для амплификации фрагмента гена Pain-1 использовали пару праймеров IV5exF (GAAGCCTCATTTGAAGTGGAC)—IVendR (AATGTATGGGTTCCTGGAAACCG). При проведении ПЦР готовили реакционную смесь объемом 15 мкл, которая содержала 1½ буфер, включающий 50 мM Трис-HCl (pH 8,6), 50 мM KCl, 0,1 % Tween 20 («Диалат Лтд.», Россия), 1,5 М MgCl2, 20 мМ dNTP, 10 мкМ соответствующего праймера, 0,25 ед. Taq ДНК-полимеразы и ~ 100 нг геномной ДНК. Амплификацию проводили на приборе Mastercycler gradient («Eppendorf», Германия) с использованием набора реактивов производства «Диалат Лтд.» (Россия). Температурно-временной профиль ПЦР: 5 мин при 94 °С; 35 циклов: 30 с при 94 °С, 40 с при 57,5 °С и 1 мин при 72 °С. Финальная элонгация: 1 мин при 72 °С. Продукты ПЦР анализировали при помощи электрофореза в 1 % агарозном геле (LE 2 Аgarose, «Хеликон», Россия) в 1½ ТВЕ-буфере с бромистым этидием при увеличении напряженности поля от 70 до 100 В/см. Результаты документировали в системе BioDoc II («Biometra GmbH», Германия). В качестве стандарта размеров фрагментов использовали коммерческие ДНК-маркеры 1 Kb и 100 bp («Thermo Fisher Scientific», США). Ам-плифицированные фрагменты секвенировали с теми же праймерами на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer («Applied Biosystems», США).

Выравнивание, транслирование и анализ полиморфизма нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили в программе MEGA 7.0 (25). В качестве референса использовали последовательность из базы данных NCBI (GeneID:102577489).

Результаты . Нуклеотидный полиморфизм фрагмента гена Pain-1 . У изученных образцов был амплифицирован и секвенирован фрагмент С-терминальной области, содержащий последовательность с 5-го по 7-й экзон. Длина полученных последовательностей фрагмента гена Pain-1 у всех анализируемых образцов не различалась и составила 707 п.н. Наиболее протяженным был 7-й экзон (199 п.н.), самым коротким — 6-й экзон (91 п.н.). Инделей в последовательностях анализируемых образцов не обнаружили, тогда как у сорта Брянский ранний в предыдущих исследованиях мы показали наличие 11-нуклеотидной делеции (CAAGCTTATAT) и мононуклеотидной инсерции (T) в 6-м интроне VI (20).

Уровень полиморфизма анализируемых последовательностей гена кислой вакуолярной инвертазы у 69 сортов и линий картофеля в среднем составил 9,33 %. Всего было выявлено 66 SNPs (42 SNPs в экзонах и 24 SNPs в интронах). Среди обнаруженных единичных нуклеотидных замен 24 SNPs локализовались в последовательностях интронов, причем в целом интронный полиморфизм оказался выше экзонного, достигая 10,16 %.

Особый интерес для изучения аллельных вариантов представляют экзонные последовательности, так как именно они кодируют аминокислоты, и изменения в экзонах в итоге может привести к функциональным изменениям белка. В анализируемых экзонных последовательностях (5-7-й экзоны) у 69 сортов и линий картофеля мы обнаружили 42 SNPs, что составило 8,91 % от общей длины исследованных экзонов. Такая степень полиморфизма в экзонах неожиданно высока в сравнении с выявленной в предыдущих исследованиях гена вакуолярной инвертазы. Так, при изучении кДНК генов-гомологов Pain-1 у 219 образцов картофеля описаны 28 единичных точечных замен, при этом 24 SNPs были детектированы в анализируемом фрагменте (5-й экзон—7-й экзон) (17). Кроме того, нами ранее был изучен полиморфизм этого гена у набора из 19 сортов российской селекции и выявлены 25 SNPs в указанном фрагменте гена кислой вакуо-134

лярной инвертазы при общей степени полиморфизма 3,53 % (20).

Последовательности 5-7-го экзонов гена Pain-1 были проанализированы на наличие известных (17, 20) и новых, еще не выявленных у других сортов нуклеотидных замен. В результате оказалось, что среди SNPs, найденных у 69 изученных образцов сортов и линий картофеля, SNP₁₅₄₄, SNP₁₅₇₄, SNP 1596 , SNP 1629 , SNP 1661 , SNP 1843 , SNP 1857 , SNP 1895 , SNP 1896 (обозначены согласно порядковому номеру нуклеотида на кДНК) уже описаны ранее (17, 20). В кодирующих последовательностях образцов выявили 34 нуклеотидные замены, из которых 25 не были описаны до этого времени: SNP₁ 6 ₂₈, SNP 1648 , SNP 1700 , SNP 1709 , SNP 1717 , SNP 1724 , SNP 1726 , SNP 1738 , SNP 1788 , SNP 1794 , SNP 1797 , SNP 1808 , SNP 1815 , SNP 1818 , SNP 1831 , SNP 1837 , SNP 1847 , SNP 1861 , SNP 1865 , SNP 1872 , SNP 1885 , SNP 1886 , SNP 1890 , SNP 1907 , SNP 1909 .

Сообщалось, что определенные нуклеотидные замены в первичной последовательности Pain-1 могут быть ассоциированы с хозяйственно ценными признаками, такими как повышенное содержание крахмала (17). В составе исследуемого участка нами была найдена значимая замена SNP₁₅₄₄ (C/A), которая коррелирует с увеличением количества крахмала в клубнях и выявлена в гомозиготном состоянии у сортов Улан и Астана. У сортов Кортни, Кураж, Елизавета, Жуковский ранний, Рябинушка, Фаворит, Вектор, Инноватор, Кузнечанка также присутствовала замена SNP₁₅₄₄, но в гетерозиготном состоянии. Ранее наличие SNP₁₅₄₄ было показано еще для одного сорта российской селекции — Брянский ранний (20).

Аллельные варианты фрагмента гена Pain-1 у сортов и линий картофеля. Всего в анализируемом наборе из 69 образцов сортов и линий картофеля мы обнаружили 78 аллельных вариантов фрагмента гена кислой вакуолярной инвертазы Pain-1 (данные представлены в online версии статьи на сайте , табл. 1). При этом 64 аллельных варианта оказались уникальными, 14 — общими для нескольких образцов. Наиболее распространенными были аллельные варианты Pain-1_A62 (у 13 образцов), Pain-1_A63, Pain-1_A64 (у 6 образцов), Pain-1_A12 (у 5 образцов). Каждый из аллельных вариантов Pain-1_A1, Pain-1_A28, Pain-1_A34, Pain-1_A36, Pain-1_A37, Pain-1_A38, Pain-1_A46, Pain-1_A65 повторялся у двух образцов. Для 15 сортов (Астана, Дидар, Карассайский, Мирас, Ушконир, Огниво, Лилея, Крепыш, Хозяюшка, Валентино, Наяда, Каменский, Леди Леди Клер, Ароза, Спиридон) были выявлены сортоспецифичные аллельные варианты, уникальные для изученного набора.

Большинство из 69 анализируемых сортов и линий картофеля оказались гетерозиготными, и им соответствовали несколько аллельных вариантов. Гомозиготными по исследуемому гену были сорта Улан, Астана, Фри-телла, Огниво, Лилея, Холмогорский, Крепыш, Хозяюшка, Валентино, Наяда, Каменский, Брянский деликатесный, Клер, Ароза, Дидар, Карассай-ский, Мирас, Ушконир, Спиридон и линия 84. Аллельный вариант Pain-1_A12, выявленный у сортов Фрителла, Чернский/1 и линий 84 и 111/1, оказался общим с последовательностью S. tuberosum, представленной в базе данных NCBI (GeneID:102577489) (см. , табл. 1).

Таким образом, в анализируемом фрагменте 5-й экзон—7-й экзон гена Pain-1 у 69 образцов сортов и линий картофеля выявлено 78 аллельных вариантов (см. , табл. 1), что указывает на высокую степень полиморфизма. Раннее для полноразмерной кодирующей последовательности гена кислой вакуолярной инвертазы было описано только 11 аллельных вариантов (17) и 9 аллельных вариантов обнаружили у 19 сортов российской, белорусской и казахстанской селекции (20).

Анализ полиморфизма аминокислотных последователь- ностей. Нуклеотидные последовательности экзонов были транслированы и проведен анализ предполагаемой аминокислотной последовательности белка. Кислая вакуолярная инвертаза картофеля состоит из 639 а.о. Длина доступной для анализа последовательности, которую кодирует фрагмент 5-й экзон—стоп-кодон, составила 156 а.о., что соответствует аминокислотным позициям в белке с 484-й по 639-ю. В качестве референсной нами была выбрана последовательность β-фруктозидазы картофеля S. tuberosum из базы данных NCBI GenBank (NP_001274993.1).

Всего в исследуемых последовательностях было выявлено 27 сайтов замещений аминокислотных остатков (данные представлены в online версии статьи на сайте , табл. 2). При этом для большинства образцов оказалось характерно наличие одиночных аминокислотных замен. Вместе с тем у некоторых образцов мы обнаружили одинаковые наборы аминокислотных замен — единообразные аминокислотные паттерны. Так, общим аминокислотным паттерном характеризовались восемь сортов картофеля (Манифест, Арсена, Метеор, Лига, Бриз, Весна белая, Колобок и Зольский). Еще один общий аминокислотный паттерн был присущ для сортов Ароза, Крепыш, Дидар, Карасайский, Мирас и Каменский (см. , табл. 2).

Наибольшее число аминокислотных замен мы обнаружили у сорта Жуковский ранний (8 замен) и линий 165 (8 замен) и 162 (7 замен). Подавляющее большинство образцов имели 3-5 замен. Отсутствие аминокислотных замен в сравнении с референсной последовательностью было показано для сорта Фрителла и линии 84 (см. , табл. 2).

Анализируемые образцы картофеля разделились на три типа: первый тип — гомозиготные и, как следствие, имеющие один вариант аминокислотной последовательности (Улан, Астана, Фрителла, Огниво, Лилея, Холмогорский, Крепыш, Хозяюшка, Валентино, Наяда, Каменский, Брянский деликатесный, Леди Леди Клер, Ароза, Дидар, Карассайский, Мирас, Ушконир, Спиридон, линия 84); второй тип — образцы с гетерозиготным состоянием нуклеотидных последовательностей, в которых выявленные SNPs не приводят к замещениям аминокислотных остатков и изменению аминокислотной последовательности (сорта Башкирский и Очарование, линии 27 и 58); наконец, третий тип — сорта и линии, гетерозиготные по нуклеотидным последовательностям, у которых разные аллели гена кодируют неодинаковые аминокислотные последовательности (оставшиеся 34 сорта и 11 линий картофеля).

Ранее при анализе замен по конкретным аминокислотным сайтам было показано присутствие только двух вариантов аминокислотных остатков (17). В настоящей работе для подавляющего большинства выявленных полиморфных сайтов тоже было характерно наличие только двух вариантов аминокислотных остатков. Например, по положению 515 у всех изученных сортов и линий находился либо остаток треонина (Т), либо остаток лизина (К) (см. , табл. 2). Однако для двух сайтов в аминокислотной последовательности белка (аминокислотные остатки 629-й и 639-й) мы обнаружили наличие трех вариантов замен. Так, в положении 629 у сортов Ред Скарлет, Янтарь, Башкирский, Спиридон, Елизавета, Жуковский ранний и линии 9 находился глицин (G), у сорта Валентино — серин (S), у всех остальных сортов и линий — аланин (А). У сортов Фри-телла, Чернский, Ред Скарлет, Красавчик, Холмогорский, Ньютон, Ала-дин, Надежда, Фаворит, Астана и линий 84, 58, 111, 152, 141, 7, 46, 162 632-м аминокислотным остатком в белке Pain-1 был аргинин (R), у сортов Лилея, Огниво, Янтарь, Ароза, Крепыш, Дидар, Карасайский, Мирас, Ка-136

менский, Хозяюшка, Ушконир, Кортни, Елизавета, Кураж, Рябинушка, Вектор — пролин (Р), у сортов Брянский деликатесный, Очарование, Клер, Наяда, Башкирский, Спиридон, Леди Розета и линии 27 — глутамин (Q). У остальных образцов аминокислотные остатки варьировали в зависимости от аллеля (см. , табл. 2).

Как уже отмечалось, наиболее важна замена SNP1544, которая приводит к замещению треонина лизином (T515K). При этом присутствие лизинового остатка коррелирует с высоким содержанием крахмала (17). Среди проанализированных образцов эту замену выявили у сортов казахстанской селекции Улан и Астана, а также в геторозиготном состоянии у сортов Кузнечанка, Сиреневый туман, Кортни, Елизавета, Кураж, Инноватор, Рябинушка, Жуковский ранний, Вектор и Фаворит.

Итак, нами проведен анализ нуклеотидного и аминокислотного полиморфизма фрагмента гена кислой вакуолярной инвертазы у 69 сортов и линий картофеля, которые ранее по этому признаку не исследовались. Показано наличие 42 SNPs, из которых 34 сайта описаны впервые. Представленные данные свидетельствуют о высокой степени полиморфизма фрагмента гена у изученных образцов. Выявлено наличие 78 аллельных вариантов фрагмента гена Pain-1 , что в дальнейшем может использоваться в селекции для создания сортов с повышенным содержанием крахмала.