Alteration of SH-group contents in red beet roots and vacuoles under osmotic stress

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили корнеплоды столовой свеклы (Beta vulgaris L.), сорт Бордо. В экспериментах были использованы корнеплоды в период покоя, которые хранились при температуре 4-5оС. Эти корнеплоды подвергали гипер- и гипоосмотическому стрессу. Для создания гиперосмотического стресса корнеплоды в течение 3-х суток выдерживали (подсушивали) на открытом воздухе при комнатной температуре, что приводило к частичной потере массы корнеплодов и увеличению осмотической концентрации клеточного сока. Для создания гипоосмотического стресса очищенные корнеплоды выдерживали в течение суток в дистиллированной воде, в результате чего осмоляльность клеточного сока (общая концентрация растворенных частиц в 1 кг воды) уменьшалась. Осмоляльность оценивали на осмометре ОМКА 1Ц-01 (Россия). Характеристики стрессов приведены на рис. 1. Следует отметить, что при создании гипоосмотического стресса корнеплоды находились в воде в бескислородных условиях и поэтому подвергались гипоксии. Для сравнения был введён вариант гиперосмотического стресса с гипоксией. В этом случае корнеплоды выдерживали в растворе 1 М маннита, в результате чего получали гиперосмотический стресс, сопровождаемый гипоксией.

Содержание SH-групп определяли в гомогенате и во фракции вакуолей, выделенных их этих же корнеплодов. Выделение изолированных вакуолей проводили по описанной ранее методике (Саляев и др., 1981). Для определения суммарных тиоловых соединений 1 г корнеплода столовой свёклы или 0.2 мл фракции изолированных вакуолей гомогенизировали с 10 мл 0.1 М Трис-НСl буфера рН 7.5 с 5 мМ ЭДТА, отжимали через капроновую ткань, центрифугировали 15 мин при 5000 g на центрифуге КR-22 (Франция). В аликвотах супернатанта определяли суммарное содержание белка (Bradford, 1976) и SH-групп (Ellman, 1959). Затем для осаждения белка к 1 мл супернатанта прибавляли 10 мл охлаждённой смеси ацетона с 1 Н НСl (39:1) и центрифугировали при 8000 g в течение 20 мин. Осадок белка промывали холодным ацетоном, растворяли в 0.1 М Трис-HCI буфере рH 8.0, содержащем 1% додецилсульфат Na, и использовали для определения белковых SH-групп. О содержании небелковых SH-соединений судили по разнице между общим содержанием SH-групп в супернатанте и количеством SH-групп во фракции растворимых белков.

Общее содержание SH-групп во фракции изолированных вакуолей определялось также методом флуоресцентных зондов на спектрофлуориметре (RF-5301PC, Shimadzu). В качестве флуоресцентного зонда был использован N-(1-пиренил)малеимид, который способен связываться с SH-группами. В кювету поэтапно вносили 2.5 мл инкубационного раствора, зонд в конечной концентрации 6.6 мкМ и 0.1 мл вакуолей (концентрация белка 0.1 мг/мл). Инкубировали 15 минут при комнатной температуре. Измерение интенсивности флуоресценции зонда проводили при длине волны 396 нм (Козарезов и др., 2009).

В работе применяли следующие реактивы фирмы “Sigma-Aldrich”: Трис, 2-меркаптоэтанол, N-(1-пиренил)малеимид, 5,5-дитиобис(2-нитробензойная кислота) – реактив Элмана. Остальные реактивы были отечественного производства квалификации ХЧ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе изучали содержание тиоловых групп в покоящихся корнеплодах и во фракции изолированных вакуолей. Результаты этих исследований приведены в таблице 1. Общее содержание тиоловых групп в корнеплоде было в 2.4 раза меньше, чем во фракции изолированных вакуолей, что говорит о важной роли этого компартмента в редокс-гомеостазе растительной клетки и в её системе антиоксидантной защиты. В корнеплоде преобладали белковые тиоловые группы (56% от общего содержания SH-групп), тогда как во фракции изолированных вакуолей небелковые SH-группы (68% от общего содержания). Соотношение белковых SH-групп к небелковым, показанное в таблице 4, составляет 1.3 для корнеплода и 0.5 для фракции изолированных вакуолей, что говорит о значительном отличии по этому показателю и о существенном преобладании в вакуолях небелковых тиоловых групп.

На следующем этапе работы проводилось изучение динамики содержания тиоловых групп при разных видах осмотического стресса. В покоящемся корнеплоде, подвергнутом гипоосмотическому стрессу, отмечено небольшое (около 10%) увеличение общего содержания тиоловых групп (таблица 2) и более существенно менялось отношение белковых SH-групп к небелковым. Если в норме в гомогенате корнеплода преобладали белковые SH-группы, то при осмотическом стрессе начинают преобладать небелковые (таблица 4). В ответ на гиперосмотический стресс общее содержание тиоловых групп в корнеплоде снижалось, особенно, если этот стресс сопровождался гипоксией. Соотношение белковых SH-групп к небелковым также, как и при гипоосмотическом стрессе, отличалось от нормы и показало заметное преобладание небелковых SH-групп, хотя и не такое значительное как в варианте гипоосмотического стресса. Таким образом, при сравнении полученных данных, хорошо заметны различия, показывающие, что при более жёстком стрессе (с гипоксией) происходит более существенный сдвиг в сторону преобладания небелковых SH-групп. При сравнении изменений в составе белковых и небелковых тиоловых групп в корнеплоде при разных видах осмотического стресса отчётливо видно, что в условиях гипоосмотического стресса происходят более существенные отклонения от нормы по сравнению с гиперосмотическим стрессом.

По литературным данным, полученным, главным образом, на животных объектах, известно, что при разных стрессовых воздействиях происходит снижение общего содержания SH-групп. Так, Byshneva и Senchuk (2002) отмечали снижение в общем содержании SH-групп в хрусталике глаза после воздействия ультрафиолетовым излучением. В экспериментах, проведённых на мышцах мышей, было показано, что ишемические повреждения целостности мышц приводили к значительному (более чем в 3 раза) снижению общего содержания тиоловых групп (Hosseinzaden et al., 2007). При обработке печени крыс переменным низкочастотным магнитным полем также было отмечено достоверное снижение суммарного содержания тиоловых групп и был сделан вывод о том, что изменения в содержании суммарных тиоловых групп является одним из наиболее чувствительных изменений при действии стрессовых факторов (Кучина, Мартынюк, 2004).

В нашем случае общее содержание тиоловых групп во фракции вакуолей при разных видах осмотического стресса незначительное отличалось от нормы (таблица 3). Достоверное снижение на 20-25% отмечено только для гиперосмотического стресса с гипоксией. Существенное отличие было отмечено также в соотношении белковых и небелковых SH-групп (таблица 4). Так, в норме в 2 раза преобладали небелковые SH-группы, а при осмотическом стрессе – белковые, что было наиболее заметно при гипоосмотическом стрессе. Возможно это связано с защитной функцией вакуоли – с выходом из неё небелковых SH-групп в цитоплазму.

Сравнение общего содержания тиоловых групп в изолированных вакуолях проводилось двумя независимыми методами (с помощью реактива Элмана и с флуоресцентным зондом N-(1-пиренил)малеимидом) одновременно на одной фракции. Полученные результаты представлены в таблице 5. Они показали, что оба метода дают близкие результаты.

Рисунок 1. Характеристика гипо- и гиперосмотического стрессов.

Изменение массы корнеплода (А) и осмоляльности клеточного сока (Б) при разных видах осмотического стресса.

Таблица 1. Содержание SH-групп (мкмоль/мг белка) в гомогенате и во фракции изолированных вакуолей корнеплодов столовой свёклы в нормальных условиях.

Вариант опыта	Общее содержание SH-групп	Содержание белковых SH-групп	Содержание небелковых SH-групп
Гомогенат	395±18	220±22	175±20
Фракция вакуолей	949±50	300±71	649±60

Таблица 2. Содержание SH-групп в гомогенате корнеплодов столовой свёклы в норме и при разных видах осмотического стресса (в % от нормы из таблицы 1).

Вариант опыта	Общее содержание SH-групп	Содержание белковых SH-групп	Содержание небелковых SH-групп
Норма	100	100	100
Гипоосмотический стресс	115±8	41±2	203±5
Гиперосмотический стресс без гипоксии	85±6	68±3	106±5
Гиперосмотический стресс с гипоксией	76±4	46±9	114±7

Таблица 3. Содержание SH-групп во фракциях изолированных вакуолей корнеплодов столовой свёклы в норме и при разных видах осмотического стресса (в % от нормы из таблицы 1).

Вариант опыта	Общее содержание SH-групп	Содержание белковых SH-групп	Содержание небелковых SH-групп
Норма	100	100	100
Гипоосмотический стресс	94±25	223±26	85
Гиперосмотический стресс без гипоксии	89±36	165±25	77
Гиперосмотический стресс с гипоксией	74±10	158±17	70

Таблица 4. Соотношение белковых к небелковым SH-группам в гомогенате и во фракции изолированных вакуолей корнеплодов столовой свёклы в норме и при разных видах осмотического стресса.

Вариант опыта	Норма	Гипоосмотический стресс	Гиперосмотический стресс без гипоксии	Гиперосмотический стресс с гипоксией
Гомогенат	1.25	0.20	0.64	0.40
Вакуоли	0.46	2.60	2.10	2.30

Таблица 5. Сравнение данных по общему содержанию SH-групп во фракциях изолированных вакуолей корнеплодов столовой свёклы в норме и при разных видах осмотического стресса (в % от нормы) разными методами.

Вариант опыта	реактив Элмана	N-(1-пиренил)малеимид
Норма	100	100
Гипоосмотический стресс	94±25	83±9
Гиперосмотический стресс без гипоксии	89±36	76±10
Гиперосмотический стресс с гипоксией	74±10	80±24

По результатам исследований можно сделать следующие выводы:

• 1.    Во фракции изолированных вакуолей общее содержание SH-групп в расчёте на 1 мг белка в 2.4 раза больше, чем в гомогенате корнеплодов.

• 2.    При разных видах осмотического стресса и в корнеплодах и во фракции изолированных

• 3.    Соотношение белковых SH-групп к небелковым значительно различается в корнеплодах и во фракции изолированных вакуолей. Причём, если в норме в вакуолях преобладают небелковые SH-группы, а при разных видах осмотического стресса белковые,

• 4.    Изменения в содержании тиоловых групп были более выражены при гипоосмотическом стрессе, чем при гиперосмотическом. Осмотический стресс совместно с гипоксией приводит к увеличению отклонений от нормы как в общем содержании, так и в соотношении белковых и небелковых тиоловых групп.

вакуолей наблюдается, главным образом, снижение общего содержания тиоловых групп.

то в корнеплодах ситуация противоположная: в норме преобладают белковые SH-группы, а при осмотическом стрессе начинают преобладать небелковые. Изменение этих соотношений может быть связано с выходом из вакуолей небелковых SH-групп в цитоплазму.

Таким образом, результаты исследований свидетельсивуют о важной роли вакуоли в поддержании редокс-гомеостаза клетки и в антиоксидантной защите растительной клетки в условиях осмотического стресса.