Альтернативный путь дыхания в растениях: регуляция и функции

Дыхание – универсальный процесс и фундаментальная основа жизни любой живой клетки. Ежесуточно растения окисляют в дыхании от 30 до 70% ассимилированного при фотосинтезе углерода. Интермедиаты и энергия, извлекаемая в процессе дыхания, необходимы для синтеза de novo и поддержания целостности и функциональной активности клеточных структур, специализированных тканей и органов растительного организма. Дыхание – это показатель функциональной стойкости растений и равноправный фотосинтезу элемент про- дукционного процесса. Дыхание выступает как механизм, ускоряющий эволюцию. Известно, что окисление ДНК образуемыми в процессе дыхания активными формами кислорода представляет собой важнейший инструмент природного мутагенеза [1]. Поэтому проблема дыхания с научных позиций привлекает исследователей уже около двух столетий.

В лаборатории экологической физиологии растений Института биологии Коми НЦ УрО РАН исследования дыхания растений ведутся более 30 лет. Сформулированы и разработаны фундаментальные вопросы физиологии дыхания растений [2]. В настоящее время в рамках исследования механизмов регуляции дыхания растений уделяется особое внимание изучению дыхательных путей в растительной клетке в норме и при стрессе.

Дыхание – это поэтапный компартментиро-ванный процесс. Первые этапы дыхания протекают в цитоплазме, а основной продукт гликолиза – пируват – диффундирует в специализированные дыхательные органеллы – митохондрии, где подвергается окислительному декарбоксилированию в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК). В реакциях цикла образуются соединения с высоким восстановительным потенциалом – пиридиннуклеотиды НАДН и ФАДН 2 . На заключительном этапе восстановительные эквиваленты окисляются с образованием энергии в ЭТЦ, локализованной во внутренней мембране митохондрий.

Основная ЭТЦ состоит из четырех трансмембранных белковых мультиферментных комплексов, двух небольших по молекулярной массе лабильных компонентов – убихинона и цитохрома с, выполняющих функцию переносчиков электронов между комплексами, и АТФ-синтазы. Перенос пары электронов по основному цитохромному пути (ЦП) от НАДН к кислороду с последующим синтезом трех молекул АТФ является универсальным для животных и растений.

Дыхательная цепь растений сложнее и пластичнее в функциональном плане, чем животных (рис. 1). Главной уникальной особенностью митохондрий высших растений, а также многих водорослей, мхов, папоротников и некоторых грибов является способность переноса электронов с пула убихинона на О 2 через альтернативную оксидазу [3]. Этот путь устойчив к действию цианида, поэтому назван цианидустойчивым (альтернативным).

Альтернативная оксидаза (АОХ) – убихинол-кислород-оксидоредуктаза – это низкомолекулярный белок (32 кДа), представляет собой один полипептид. АОХ выделена и идентифицирована более 20 лет назад [4]. Синтез белка кодируется ядерны- ми генами – Аох [5]. В мембране АОХ существует как мономер и димер. Активация фермента связана с восстановлением дисульфидной связи в сульфгидрильную [6].

Электронный транспорт по АП не связан с двумя участками генерации мембранного потенциала (комплексы III и IV). Лишь при окислении эндогенного НАДН градиент протонов может устанавливаться в комплексе I. Поэтому АП запасает мало энергии, большая часть рассеивается в виде тепла. Другими словами, альтернативный путь транспорта электронов снижает энергетическую эффективность дыхания, как минимум, на 60%. Тогда зачем растениям нужен этот путь?

Есть мнение, что альтернативное дыхание – это возникший в процессе эволюции растений способ поддержания дыхания в присутствии цианида. Многие растения (около 2500 видов) содержат цианогенные гликозиды, распад которых сопровождается образованием синильной кислоты и цианидов. Биологическая роль этих соединений может быть защитной, направленной против фитопатогенов или травоядных животных. Однако это не объясняет, почему АОХ есть у всех растений и какую роль она выполняет в клетке.

Хорошо известно, что АП участвует в термогенезе тканей цветка некоторых ароидных. Нагревание термогенных тканей облегчает испарение соединений, привлекающих насекомых-опылителей. Благодаря этому феномену, описанному еще Ламарком в XVIII в., в 30-х гг. XX в. было открыто циа-нидрезистентное дыхание (Okunuki, 1932, 1939; Van Herk, 1937, цит. по [7]). С тех пор минул почти век, но вопрос о механизмах регуляции и физиологической роли АП в нетермогенных тканях до сих пор остается открытым [3, 8, 9, 10].

Значительный вклад в развитие представлений об активации различных оксидаз и смены дыхательных путей в зависимости от интенсивности и

надндг

НАДН

АОХ

Цикл Кребса

Матрикс

NADH

NADH сукцинат

%О, Н,0

Межмембранное пространство

Внутренняя мембрана митохондрий

% О,  НгО

н* А НАД(Ф)Н

Рис. 1. Цепь переноса электронов во внутренней мембране растительных митохондрий. Объяснения см. в тексте.

направленности процессов метаболизма, а также биологического состояния растения, внесла О.А. Семихатова. Она впервые обратила внимание на то, что в листьях разного возраста функционируют разные дыхательные системы [11]. Основную роль в дыхании молодых листьев играет цитохромокси-даза, а в зрелых – цианидустойчивая система, природа которой в то время была неизвестна [11].

Объяснение роли АП в нетермогенных тканях предложено в 1982 г. голландским ученым H. Lambers [12]. Согласно сформулированной им гипотезе «сверхпотока» («energy overflow») при насыщении цитохромного пути АП работает как «выхлопной клапан», через который «сжигается» избыток углеводов, который клетка не в состоянии эффективно использовать. Однако позже Lambers и его коллеги установили, что цитохромный и альтернативный пути дыхания конкурируют за электроны [13]. Поэтому гипотеза «сверхпотока» несколько трансформировалась. Считается, что АД участвует в поддержании баланса между углеводным метаболизмом и скоростью электронного транспорта, а именно в снижении высокого соотношения АТФ/АДФ за счет быстрого окисления НАДН без образования АТФ. При этом цикл Кребса продолжает функционировать. Такая ситуация может быть целесообразна для растений в период активного роста, когда они больше нуждаются в метаболитах для синтезов de novo , чем в АТФ. Нами показано, что скорость дыхания и подавление дыхания в присутствии специфического ингибитора АОХ были выше в корнях и листьях быстро растущих растений ячменя, чем у растений с низкой скоростью роста (рис. 2).

ем АОХ, в присутствии ингибиторов ЭТЦ [14]. Показано, что AOX участвует в стабилизации пула убихинонов (Q r /Q t ) in vivo [10]. Убедительным также является тот факт, что H 2 O 2 – вторичный мессенджер в сигнальном каскаде, приводящем к экспрессии гена Aox 1 [3].

Стимуляцию АП наблюдали при действии неблагоприятных факторов среды, которые могут вызвать окислительный стресс в клетке. Показано, что активность АП и количество белка АОХ возрастали при засухе, внедрении патогена [15], дефиците элементов минерального питания [16-18], низких положительных температурах [19-21]. В других работах не выявлено активации АОХ в ответ на действие факторов, в частности, низкой температуры [8, 21, 22]. Проанализировав литературу, мы предположили, что степень вовлечения АП и его физиологическая роль в ответ на изменение факторов зависят, в первую очередь, от силы и продолжительности действия фактора, устойчивости организма и его функционального состояния.

Нами проведены эксперименты с холодостойкими сортами ячменя ( Hordeum distichum L., с. Андрей, Новичок), длительно адаптированными к двум температурным режимам выращивания – 13/8ºС и 21/17ºС (день/ночь). Эти температуры ограничивают зону температурного оптимума роста данных сортов [23]. При пониженной температуре дыхание органов растений не проявляло чувствительности к ингибитору АОХ (рис. 3). Следовательно, можно полагать, что дыхание осуществлялось в основном по ЦП, без заметного участия АП. По-видимому, отсутствие чувствительности к ингибитору АОХ у холодостойкого сорта ячменя, выращи-

Рис. 2. Соотношение дыхательных путей в медленно- и быстрорастущих растениях ячменя ( Hordeum distichum L., с. Андрей). R G – относительная скорость роста, – SHAM-чувствительное (альтернативное) дыхание.

Рис. 3. Влияние температурного режима выращивания (день/ночь) на соотношение дыхательных путей в растениях ячменя ( Horedeum distichum L., с. Андрей). Обозначения как на рис. 2.

Другая функция АП связана с защитой клетки от окислительного стресса. Митохондрии являются местом образования активных форм кислорода (АФК), в частности супероксидрадикала и H2O2, чему способствуют торможение электронного транспорта и «перевосстановление» цепи. Активация АОХ приводит к снижению степени восстановлен-ности пула убихинонов за счет быстрого сброса электронов на кислород с образованием воды [14]. Прямым доказательством этой функции АП явились данные по накоплению АФК в тканях трансгенных растений табака с пониженным содержани- ваемого при более низкой (но в пределах температурного оптимума роста) температуре, обусловлено необходимостью сохранения максимальной энергетической эффективности дыхания для поддержания процессов жизнедеятельности. Это согласуется с современными представлениями о том, что регуляция энергетического метаболизма клетки направлена на избежание вовлечения АП [24].

В другом эксперименте изучали влияние кадмия на соотношение дыхательных путей в органах ячменя (Hordeum distichum L., сорт Новичок) при этих же температурных режимах [25]. Показано, что корни обработанных кадмием растений проявляли чувствительность к ингибитору АОХ – SHAM (рис. 4). Увеличение доли АП происходило на фоне повышения концентрации малонового диальдегида – продукта пероксидации липидов – свидетельствующем об окислительном стрессе. Известно, что АОХ препятствует генерации АФК в ЭТЦ митохондрий за счет быстрого сброса электронов на кислород и снижения степени восстановленно-сти пула убихинонов [3, 10, 19]. Значительное повышение доли АП (40% от общего дыхания) при низкой концентрации Cd (30 мкмоль/л) в корнях растений в условиях температурного режима 21/17º С, когда скорость общего дыхания еще достаточно высока, по-видимому, обусловлено необходимостью поддержания интенсивной работы ЦТК. Органические кислоты ЦТК способны связывать ТМ с последующей изоляцией в вакуоли [26]. Этот механизм мог активироваться и при сильном кадмиевом стрессе (100 мкмоль/л) в условиях более низкой температуры. Таким образом, активация АП является одним из механизмов поддержания гомеостаза подверженных стрессу кадмием клеток корней.

дыхание, снижая уровень АФК и препятствуя активации программируемой смерти клетки [27, 28]. Поэтому АОХ называют антиапоптическим белком (antiapoptotic protein) [27, 29].

В зеленых тканях растений фотосинтез и дыхание протекают в одной клетке. Однако долгое время эти процессы изучались автономно, и вопрос об их взаимодействии в фотосинтезирующей клетке остается до сих пор наименее изученным. Согласно современным данным на свету между хлоропластами и митохондриями идет активный обмен метаболитами. Дыхательные ферменты, в том числе альтернативные дегидрогеназы и АОХ в митохондриальной ЭТЦ, участвуют в окислении восстановительных эквивалентов, поступающих из цитозоля или хлоропластов в митохондрии при их близком контакте [30]. Это один из способов защиты клетки от фотоокисления.

Нами исследовано вовлечение АП в дыхание листа пшеницы в процессе его зеленения [31]. Зеленение – процесс образования хлорофилла. В этиолированных проростках дыхание осуществлялось, главным образом, по цитохромному пути (рис. 5).

Рис. 4. Влияние кадмия на соотношение дыхательных путей (А) и активность ПОЛ (Б) в корнях ячменя ( Hordeum distichum L., с. Новичок) при пониженной температуре выращивания (день/ночь – 13/8 °С). Обозначения как на рис. 2.

Необходимо также назвать еще одну возможную причину усиления дыхания по АП в варианте c высокой концентрацией кадмия и пониженной температурой. На фоне остановки роста и частичной гибели растений вовлечение АОХ могло быть вызвано процессом вынужденной гибели клеток. Согласно современным данным митохондрии – главные участники апоптоза, сигнальными молекулами которого являются АФК [27]. Повышение АФК в клетке ведет к формированию специальных пор в мембране митохондрий и выходу цит с. Возможно, что на начальном этапе, когда цитохромный путь ограничен, АОХ поддерживает митохондриальное

Время на свету, ч

Рис. 5. Дыхание листьев пшеницы ( Triticum aesti-vum L., с. Иргина) в процессе зеленения.

– V alt , – V_cyt, – V_res – активность альтернативного, цитохромного и остаточного дыхания, соответственно.

Свет индуцировал вовлечение АП, доля которого в течение суток после начала освещения возрастала до 50% от общего дыхания. В этот же период зеленение сопровождалось увеличением пространственной зависимости расположения митохондрий в зоне нахождения хлоропластов, что указывает на наличие обмена метаболитами между органеллами [31]. Эксперимент показывает, что митохондрии играют важную роль в формировании фотосинтетического аппарата, а АП может участвовать в поддержании взаимосвязи фотосинтеза и дыхания.

Таким образом, энергетически малоэффективный АП является специфическим механизмом, поддерживающим клеточный гомеостаз и функционирование растений в различных условиях среды. Вовлечение АП расширяет адаптивные возможности растительного организма, способствует поддержанию роста и защите от стресса. Убедительными являются данные об участии АОХ в термогенезе специализированных тканей цветка ароидных, поддержании окислительно-восстановительного баланса в ЭТЦ митохондрий и препятствии формирования АФК, особенно в условиях стресса. В настоящее время наиболее сильно развиваются исследования о связи альтернативного дыхания с ростом, процессом апоптоза, генерацией тепла в «нетермогенных» тканях растений при гипотермии, защитой от фотоокисления и др. Спорными остаются вопросы регуляции активности и вовлечения АОХ in vivo. Мы обратили внимание на то, что дыхание и соотношение дыхательных путей в растениях варьируют в зависимости от объекта, его функционального состояния, продолжительности и силы действия внешних факторов, устойчивости к ним растительного организма. Идея многофункциональности АП нашла подтверждение в наших экспериментах.

Необходимо отметить, что исследование альтернативного пути дыхания вышло из рамок только фундаментальной проблемы. Показатели дыхания и соотношения дыхательных путей могут быть использованы для выявления реакции растений в ответ на изменение условий среды (глобальное потепление, увеличение СО 2 в атмосфере). Показано усиление активности АП в листьях Arabi-dopsis thaliana , селектированных для роста в условиях повышенной концентрации СО 2 [32]. В экспериментах, направленных на борьбу с митохондриальными болезнями человека, показано, что ген АОХ может быть успешно введен в человеческие клетки почки и фибробласты. Мутантные клетки проявляли толерантность к дефициту цитохромок-сидазы [33].

В заключение следует сказать, что вопросы регуляции активности и вовлечения альтернативного дыхания находятся в настоящее время в центре особенного внимания экспериментальных биологов, особенно за рубежом (Physiologia plantrum, Vol. 129, 2007; Vol. 137, 2009). Интенсивное получение сведений о функционировании этого уникального пути в растениях, с одной стороны, приближает нас к разгадке вопроса о причинах активации альтернативной оксидазы in vitro , in vivo , in situ , с другой – ставит перед исследователями много новых задач. Зная законы регуляции соотношения дыхательных путей, можно контролировать (на молекулярногенетическом уровне) жизнедеятельность не только, как оказалось, растений, но и человека. Надеемся, что мы внесем свою лепту в поток этой важной информации.

Автор признательна своему научному руководителю профессору Т.К. Головко, вдохновившей на изучение этой проблемы, а также за ценные советы при обсуждении работы.