Аминокислоты как биомаркеры фазового состава холелитов

Желчнокаменная болезнь (холелитиаз) является одним из самых распространенных гастроэнтерологических заболеваний во всем мире. Тактика лечения и предотвращения данного заболевания остается наиболее актуальной задачей современной медицины [10].

Процесс образования желчных камней (холелитов) до конца не исследован из-за скрытого протекания начальной стадии желчнокаменной болезни. В целом считается, что холелитиаз — многофакторное и многостадийное заболевание, характеризующееся нарушением в первую очередь обмена холестерина или билирубина с

образованием холелитов. К общим факторам развития желчнокаменной болезни относят: экологическое неблагополучие, различные нарушения обмена веществ (дисгормональные, воспалительные заболевания органов системы пищеварения, наследственная склонность и др.), особенности питания, образ жизни человека (гиподинамия, алкоголь, курение, стресс и др.), приём некоторых лекарственных препаратов, возраст. В состав холелитов входят соединения органического и неорганического состава: холестерин, пигмент (билирубин), желчные кислоты, минеральные фазы (карбонат кальция, фосфат кальция), микроэлементы (кальций, железо, медь, магний, цинк, натрий и др.) и белковая компонента. По мнению А. А. Кораго [7], несмотря на присутствие в холелитах различных веществ, в целом их следует разделять на две группы по основным составляющим — холестерину (холестериновые) и билирубину (пигментные). Среди веществ, присутствующих в составе холелитов, наименее исследована белковая компонента, структурными единицами которой являются аминокислоты. Об аминокислотном составе желчных камней известно не так много [8, 15]. Какую роль играют белки в формировании холелитов — вопрос до конца не изученный. Обнаружение белков в холелитах не дает точного ответа, являются ли они причиной образования желчных камней или выполняют второстепенную роль. На сегодняшний день мало данных о том, какие белки участвуют в формировании холелитов разного состава.

В составе пигментных камней установлены белки с высоким содержанием кислых аминокислот (аспарагиновой и глутаминовой) — это альбумин [23], остео-понтин [18] и низкомолекулярные белки [19].

В образовании холестериновых холелитов участвуют муцины MUC3 и MUC5B [25], гликопротеины с разными молекулярными массами [21], аполипопротеины [16]. Основную массу белков этих соединений слагают серин, треонин, пролин, лейцин и аланин. Есть данные [3], что в холестериновых холелитах могут присутствовать продукты неполной диссоциации белков в виде димеров, тримеров и олигомеров аминокислот.

Цель исследования — выявление закономерностей изменения аминокислотного состава при формировании холелитов различных фазовых составов методами статистического анализа для решения вопросов прогнозирования типа холелитиаза и метафилактики, определяющих специфику лечения. В задачи исследования входило установление по аминокислотному составу схожести холелитов одного фазового состава и различий холелитов разных фазовых составов, выявление индивидуальных аминокислот, показывающих статистически значимые отличия холелитов разных фазовых составов.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования послужили 23 образца холелитов, принадлежащих жителям Республики Коми, холестеринового и пигментного типов, выделенных в соответствии с классификацией Кораго [7]. Для них были определены содержания 12 аминокислот: аланина (Ala), валина (Val), глицина (Gly), изолейцина (Ile), лейцина (Leu), лизина (Lys), аспарагиновой кислоты (Asp), глутаминовой кислоты (Glu), серина (Ser), фенилаланина (Phe), тирозина (Tyr), пролина (Pro). Идентификация и определение содержания аминокислот в образцах выполнены на газовом хроматографе GC-17A (Shimadzu, капиллярная колонка Chirasil-L-Val). Для извлечения аминокислот из образцов применяли кислотный гидролиз в 6М HCl при t 105 °С в течение 12 часов. Выделенные из гидролизата аминокислоты очищали от примесей и переводили в N-пентафторпропионовые изопропиловые эфиры соответствующих аминокислот. Методика определения аминокислотного состава подробно описана в работе [14].

Для выявления взаимосвязи фазового состава холелитов (холестерин, билирубин, фосфат кальция, карбонат кальция) с аминокислотным составом нами были привлечены статистические методы исследования с использованием программного продукта Statistica 6.0. Выявление групп холелитов, схожих по аминокислотному составу, проводилось иерархическим агломератив-ным кластерным анализом (мера расстояния между кластерами — евклидово расстояние, правило связи кластеров — метод полной связи) [13]. Для установления индивидуальных аминокислот, по содержанию которых холелиты разных типов различаются статистически значимо, использовались непараметрический критерий Манна — Уитни и параметрический непарный критерий Стьюдента. Многомерный метод деревья классификации был применен для выявления наиболее информативных аминокислот и построения по ним моделей классификации образцов холелитов. Статистическая оценка проводилась для заданного критического уровня значимости 0.05.

Ранее подобные исследования были проведены нами для выявления и подтверждения существования взаимосвязи аминокислотного состава патогенных биоминералов — уролитов (мочевых камней) — с их минеральной составляющей [1, 6].

Результаты исследований

Кластерный анализ

По результатам кластерного анализа холелиты по содержаниям аминокислот группируются в два сильно различающихся кластера — холестериновых и пигментных холелитов (рис. 1). Оказалось, что кластер холестериновых холелитов, в свою очередь, состоит из двух кластеров. Анализ образцов каждого из этих кластеров показал, что один содержит холелиты холестеринового состава, второй — холелиты, состоящие из холестерина и минеральной компоненты (карбонат кальция, фосфат кальция). Таким образом, на основании результатов кластерного анализа холестериновый тип можно разделить на два подтипа — холестериновый и холестериновый с минеральной составляющей. Поэтому далее в статье будем рассматривать три типа холелитов — холестериновый, холестериновый с минеральной компонентой и пигментный. Заметим, каждый кластер содержит образцы холелитов только одного типа. Это показывает, что холелиты одного фазового состава схожи между собой по составу аминокислот. Как видно на рис. 1, по составу аминокислот наиболее неоднородны пигментные холелиты. Содержания аминокислот в холелитах разных типов приведены в табл. 1.

(Рсв/Рмакс)'1ОО %

Рис. 1. Дендрограмма кластеров холелитов, схожих по аминокислотному составу, полученная иерархическим агломеративным кластерным анализом (мера расстояния между кластерами — евклидово расстояние, правило связи кластеров — метод полной связи). На оси ординат — образцы холелитов трех типов: 1—8 — холестеринового, 9—16 — холестеринового с минеральной компонентой, 17—23 — пигментного. По оси абсцисс — расстояния объединения кластеров, представленные в масштабируемом в процентах виде: (расстояние связи / максимальное расстояние) * 100 %

Fig. 1. A dendrogram of clusters gallstones similar amino acid composition, obtained using hierarchical agglomerative cluster analysis (measure the distance between clusters is the Euclidean distance, the connecting rule of clusters is the method of complete linkage). Designation. On the y-axis marked samples gallstones: 1—8 — cholesterol type, 9—16 — cholesterol with mineral component type, 17—23 — pigment type. On the x-axis is the distance of the joining of clusters presented in a scaled in percent form: (connection distance / maximum distance) * 100 %

Нормальный закон распределения

Проведение проверки нормальности законов распределения содержаний аминокислот холелитов каждого типа обусловлено выбором статистических критериев и методов (параметрических или непараметрических) для дальнейшего корректного анализа данных. Для этого были использованы критерии Шапиро — Уилка (статистика W), Колмогорова — Смирнова с поправкой Лиллиефорса (статистика d), оценки значений коэффициентов асимметрии А и эксцесса Е (абсолютные значения обоих не превышают единицы), визуальный анализ нормальных вероятностных графиков. По результатам проведенной проверки близкие к нормальному распределению имеют не более пяти аминокислот для каждого типа. Для холестериновых холелитов это Val (W = 0.949; p = 0.699; d = 0.180; p > 0.20; A = -0.35; E = -0.19), Glu (W = 0.961; p = 0.816; d = 0.159; p > 0.20; A = 0,53; E = -0.29), для холестериновых с минеральной компонентой это Ile (W = 0.962; p = 0.833; d = 0.140; p > 0.20; A = -0.54; E = 0.14), Tyr (W = 0.883; p = 0.203; d = 0.234; p < 0.20; A = 0.63; E = -0.64), для пигментных это Val (W = 0.959; p = 0.814; d = 0.135; p > 0.20; A = -0.68; E = -0.16), Gly (W = 0.916; p = 0.438; d = 0.189; p > 0.20; A = 0.69; E = -0.64), Ser (W = 0.951; p = 0.741; d = 0.196; p > 0.20; A = -0.22; E = 0.24), Leu (W = 0.952; p = 0.746; d = 0.158; p > 0.20; A = 0.34; E = -0.68), Glu (W = 0.965; p = 0.863; d = 0.162; p > 0.20; A = -0.08; E = -0.75). Отметим, что ни одна из аминокислот не подчиняется закону нормального распределения для всех трёх типов холелитов одновременно. Только 24

содержания Val и Glu имеют распределения, близкие к нормальному, для холестеринового и пигментного типов холелитов. Поэтому для выявления различий содержаний Val и Glu в образцах этих двух типов можно использовать непарный критерий Стьюдента (параметрический статистический метод сравнения двух независимых групп объектов по одному признаку). Для парного сравнения холелитов разных типов по содержаниям остальных аминокислот использовался непараметрический критерий Манна - Уитни.

Критерии Манна — Уитни и Стьюдента

При попарном сравнении всех трёх типов холелитов использовался скорректированный критический уровень значимости 0.017, вычисленный по заданному критическому уровню значимости 0.05. Корректировка критического уровня значимости при попарном сравнении нескольких типов связана с проблемой множественных сравнений [9]. Установлено, что все три типа холелитов статистически значимо (p<0,05) различаются по содержаниям аминокислот Ala, Val, Ile, Leu, Pro, Phe, Asp и Glu. Результаты расчетов критериев Манна -Уитни и Стьюдента приведены в табл. 2 и 3. Причем по Val и Glu оба критерия (Манна - Уитни, непарный Стьюдента) показали наличие статистически значимых различий. По содержанию Gly холелиты холестеринового с минеральной компонентой и пигментного типов статистически значимо (p < 0.017) отличаются от холестериновых, но не различаются между собой (табл. 2). Холестериновые холелиты характеризуются низкими содержаниями Gly по сравнению с холесте-

Таблица 1. Описательные статистики содержаний аминокислот (мг/г) в желчных камнях Table 1. Descriptive statistics of amino acid contents in gallstones

Аминокислота Amino acid	Тип холелита / Type of cholelite
	Холестериновый Cholesterol		Холестериновый с минеральной компонентой Cholesterol with mineral component		Пигментный Pigment
	Me		Me		Me
	Min	Max	Min	Max	Min	Max
Ala	0.136		0.461		1.526
	0.081	0.346	0.301	0.706	1.217	2.423
Val	0.077		0.403		1.116
	0.0	0.136	0.204	0.541	0.460	1.470
Gly	0.695		1.757		7.528
	0.361	1.149	0.979	4.164	1.216	21.974
Ile	0.033		0.144		0.706
	0.0	0.058	0.0	0.236	0.264	0.860
Ser	0.336		0.438		1.119
	0.075	0.470	0.240	0.562	0.397	1.817
Leu	0.124		0.736		1.893
	0.058	0.237	0.315	0.939	1.455	2.315
Pro	0.068		0.326		0.949
	0.0	0.135	0.249	0.619	0.476	1.319
Asp	0.104		0.471		1.716
	0.0	0.240	0.326	0.971	1.273	4.286
Glu	0.163		0.564		2.373
	0.035	0.358	0.228	1.314	1.475	3.205
Phe	0.096		0.302		1.013
	0.024	0.141	0.255	0.454	0.879	1.329
Tyr	0.0		0.094		1.029
	0.0	0.089	0.0	0.254	0.182	1.551
Lys	0.073		0.110		0.848
	0.0	0.116	0.031	0.579	0.051	1.238

Примечание: Me — медианное среднее значение, Min, Max — минимальное и максимальное значения.

Note: Me — median average value; Min, Max — minimum and maximum values.

риновыми с минеральной компонентой и пигментными (табл. 1). По содержаниям Ser, Tyr, Lys холелиты холестеринового и холестеринового с минеральной компонентой типов статистически значимо отличаются от пигментных, но не различаются между собой (табл. 2). Пигментные холелиты имеют более высокие содержания Ser, Tyr и Lys, чем холестериновые с минеральной компонентой и холестериновые (табл. 1).

Деревья классификации

Таблица 2. Результаты расчёта критерия Манна — Уитни

Table 2. Results of Mann — Whitney test calculation

Аминокислота Amino acid	Сравниваемые типы холелитов / Compared types of cholelites
	Холестериновые (П 1 =8)и холестериновые с минеральной компонентой (П 2 =8) Cholesterol (n i =8) and cholesterol with mineral component (n 2 =8)			Холестериновые (n 1 =8) и пигментные (n 2 =7) Cholesterol (П 1 =8) and pigment (n 2 =7)			Холестериновые с минеральной компонентой (n 1 =8) и пигментные (П 2 =7) Cholesterol with mineral component (n 1 =8) and pigment (n 2 =7)
	U	Z	p	U	Z	p	U	Z	p
Ala	2.0	-3.151	0.002	0.0	-3.240	0.001	0.0	-3.240	0.001
Val	0.0	-3.361	0.001	0.0	-3.240	0.001	3.0	-2.893	0.004
Gly	4.0	-2.941	0.003	0.0	-3.240	0.001	13.0	-1.736	0.083
Ile	6.5	-2.678	0.007	0.0	-3.240	0.001	0.0	-3.240	0.001
Ser	15.0	-1.785	0.074	1.0	-3.125	0.002	5.0	-2.662	0.008
Leu	0.0	-3.361	0.001	0.0	-3.240	0.001	0.0	-3.240	0.001
Pro	0.0	-3.361	0.001	0.0	-3.240	0.001	2.0	-3.009	0.003
Asp	0.0	-3.361	0.001	0.0	-3.240	0.001	0.0	-3.240	0.001
Glu	2.0	-3.151	0.002	0.0	-3.240	0.001	0.0	-3.240	0.001
Phe	0.0	-3.361	0.001	0.0	-3.240	0.001	0.0	-3.240	0.001
Tyr	12.0	-2.100	0.036	0.0	-3.240	0.001	3.0	-2.893	0.004
Lys	18.0	-1.470	0.142	5.0	-2.662	0.008	6.0	-2.546	0.011

Примечание: П 1 , П 2 — количества образцов холелитов соответствующего типа, U — значение критерия Манна — Уитни, p — достигнутый уровень значимости.

Note: n₁ П 2 — numbers of each type of gallstones; U — the value of the Mann — Whitney test; p — achieved level of significance.

Таблица 3. Результаты расчётов непарного критерия Стьюдента проверки гипотезы равенства средних и критерия Левена проверки гипотезы равенства дисперсий содержаний аминокислот Val, Glu для холестеринового (8 образцов) и пигментного (7 образцов) типов холелитов

Table 3. Results of calculations of unpaired Student's t-test for test of means equality hypothesis and Levene's test for test of equality of variance hypothesis for contents of Val, Glu amino acids in gallstones of cholesterol (8 samples) and pigment (7 samples) types

Аминокислота Amino acid	XI	X2	s1	s2	Левена F(1,df) Leven F(1,df)	df	p Левена p Leven	t	df	p двуст.
Val	0.077	1.059	0.045	0.353	13.340	13	0.003	-7.317	6.17	2.9E-04
Glu	0.182	2.340	0.105	0.610	7.997	13	0.014	-9.245	6.31	6.7E-05

Примечание: XI — среднее содержание аминокислоты в холелитах холестеринового типа, Х2 — среднее содержание аминокислоты в холелитах пигментного типа, s 1 — стандартное отклонение для холестеринового типа, s 2 — стандартное отклонение для пигментного типа, F — значение критерия Левена, t — значение критерия Стьюдента с разделёнными оценками дисперсий, df — число степеней свободы, p — достигнутый уровень значимости.

Note: X I — average amino acid content in the gallstones cholesterol type, X2 — the average amino acid content in the gallstones pigment type, s₁ — the standard deviation for cholesterol type, s₂ — the standard deviation for pigment type, F — the value of Levene's test, t — the value of Student's t—test with separate estimates of variances, df — the number of degrees of freedom, p — achieved level of significance.

Все деревья классификации, полученные тремя типами ветвления, дают быстрые (короткие) решения — 2 ветвления, 3 терминальные вершины — и верно классифицируют все образцы: каждая из терминальных вершин не содержит неправильно классифицированных образцов (рис. 2, 4).

Так, для дерева классификации, полученного дискриминантным одномерным ветвлением для категориальных и порядковых предикторов, классификация образцов происходит с помощью двух ветвлений по содержанию фенилаланина (рис. 2). Сначала первым ветвлением отделяются все пигментные холелиты от остальных, вторым ветвлением разделяются холестериновые и холестериновые с минеральной компонентой холелиты. Таким образом, холелиты разных типов 26

хорошо различаются по содержанию одной аминокислоты — Phe. Диапазоны варьирования содержаний Phe в холелитах трёх типов не пересекаются (табл. 1, рис. 3). Установлено, что наибольшие концентрации фенилаланина характерны для пигментных холелитов, а наименьшие — для холелитов холестеринового типа. То же самое наблюдается для Leu, Asp. Таким образом, образцы холелитов можно классифицировать по содержанию Phe, а аминокислоты Leu и Asp использовать как вспомогательные индикаторы классификации. Визуальный анализ варьирования содержаний этих трёх аминокислот во всех исследуемых типах холелитов (табл. 1) показал, что именно для Phe характерны наименьшие степени разбросанности (рассеивания) содержаний для каждого исследуемого типа холелитов по сравнению с Leu, Asp.

Рис. 2. Граф дерева классификации образцов желчных камней, полученный по составу 12 аминокислот (тип ветвления — дискриминантное одномерное ветвление для категориальных и порядковых предикторов, априорные вероятности: 0.42 — холестериновые, 0.48 — холестериновые с минеральной компонентой, 0.1 — пигментные). Обозначения: 1 — холестериновый тип, 2 — холестериновый с минеральной компонентой тип, 3 — пигментный тип

Fig. 2. The graph of classification tree of gallstones on composition of 12 amino acids (split selection method — Discriminant-based univariate split for categorical and ordered predictors, a priori probabilities: 0.42 — cholesterol type, 0.48 — cholesterol with mineral component type, 0.1 — pigment type). Designation: 1 — cholesterol type, 2 — cholesterol with mineral component type, 3 — pigment type

° холестериновый тип п холестериновый с минеральной компонентой тип пигментный тип

(ЮОСЮ (Ш □  □□               ООО о       о о>

0.0           0.2           0.4           0.6           0.8           1.0            1.2           1,4

содержание Phe, мг/г

Рис. 3. Изменение содержаний Phe в холелитах трёх типов Fig. 3. Change of Phe contents in gallstones three types

Обсуждение результатов

На основании статистических исследований установлено, что все изученные типы холелитов статистически значимо различаются по содержаниям аланина, изолейцина, лейцина, пролина, валина, фенилаланина, глутаминовой и аспарагиновой кислот (табл. 2). Самые низкие содержания перечисленных аминокислот определены в холестериновых желчных камнях, самые высокие — в пигментных, что указывает на разные условия образования холелитов различного фазового состава.

Согласно результатам статистического анализа особое внимание следует обратить на аминокислоту Phe. Она наиболее чётко по сравнению с другими отмеченными аминокислотами различает холелиты разного фазового состава, и эти различия статистически значимы. Фенилаланин относится к незаменимым амино- 27

Рис. 4. Граф дерева классификации образцов желчных камней, полученный по составу 12 аминокислот (тип ветвления — полный перебор для одномерных ветвлений по методу C&RT, априорные вероятности: 0.42 — холестериновые, 0.48 — холестериновые с минеральной компонентой, 0.1 — пигментные). Обозначения см. на рис. 2

Fig. 4. The graph of classification tree of gallstones on composition of 12 amino acids (split selection method — C&RT-style exhaustive search for univariate splits, a priori probabilities: 0.42 — cholesterol type, 0.48 — cholesterol with mineral component type, 0.1 — pigment type). See fig. 2 for symbols

кислотам, поскольку ткани организма человека не обладают способностью синтеза его бензольного кольца. Поступая в организм из разных источников пищи, он используется в первую очередь для синтеза различных белков; оставшийся неиспользованный запас аминокислоты под действием фермента монооксигеназы — фенилаланингидроксилазы — превращается в тирозин [11]. Фенилаланин в значительных количествах входит в состав молекул белков системы крови, таких как инсулин, альбумин, гемоглобин, фибрин. Основными патологическими факторами, влияющими на повышение концентрации свободного фенилаланина в крови, являются катаболизм (распад) белков и нарушения функции печени [20, 22]. Есть мнение [2], что пигментные желчные камни образуются на фоне глубоких изменений в работе печени, с чем, вероятно, и связаны высокие содержания фенилаланина в пигментных холелитах.

В результате исследования было установлено, что в холестериновых образцах с минеральной составляющей содержания аминокислот выше, чем в холестериновых камнях без минеральной компоненты (табл. 1). Повышение содержания белковой компоненты происходит за счет увеличения содержаний отдельных аминокислот: аланина, валина, глицина, изолейцина, лейцина, пролина, тирозина, фенилаланина, аспарагиновой и глутаминовой кислот. Вероятно, данные аминокислоты имеют связь с минеральной составляющей. Многие белки, в состав которых входят перечисленные аминокислоты, способствуют образованию карбонатных и фосфатных минералов, как в природных условиях, так и в экспериментальных. Например, в природных условиях образование раковин моллюсков, состоящих из карбоната кальция, не происходит без участия белка конхиолина, характеризующегося большим содержанием кислых аминокислот [5]. Экспериментально выяснено, что в присутствии альбумина образуется карбонатный минерал — ватерит [12, 24]. Тем самым можно 28

полагать, что определенные белки способствуют процессу образования минеральных фаз.

По нашим данным, содержание глицина в холестериновых холелитах статистически значимо ниже, чем в холелитах холестеринового с минеральной компонентой и пигментного типов (табл. 1, 2). В холелитах этих двух типов содержания глицина не различаются статистически значимо. Глицин — простейшая аминокислота — является составляющей не только белков, но и гликохолевой кислоты (продукт конъюгации холевой кислоты и глицина), присутствующей в желчи. Таким образом, повышенные содержания глицина в пигментных и холестериновых с минеральной компонентой холелитах в отличие от холестериновых, по-видимому, обусловлены не только вхождением его в белки, но и связаны с присутствием гликохолевой кислоты.

Таким образом, каждый тип холелитов характеризуется своими особенностями аминокислотного, а следовательно и белкового состава, что указывает на различие биохимических процессов, протекающих при формировании холелитов.

Как упоминалось выше, в холелитах могут присутствовать самые различные белковые вещества системы крови, гепатобилиарной системы, а также специфичные белки. На данный момент точно не установлено, какие белки участвуют в формировании холелитов разного состава, в связи с чем исследование их аминокислотного состава является важным аспектом, дающим информацию о возможном составе белковых веществ, принимающих участие в образовании холелитов.

Следует отметить, что установление белкового состава патогенных биоминералов требует существенных и трудоемких исследований, тогда как аминокислотный анализ проще в пробоподготовке и расшифровке результатов, но является не менее информативным и более доступным исследователю.

Выводы

Статистический анализ, примененный в данной работе для изучения патогенных образований в организме человека, позволил получить новые результаты, которые могут быть использованы для решения проблемы образования желчных камней, представляющей серьёзную опасность для здоровья человека.

Результаты проведенного исследования особенностей аминокислотного состава холелитов разного фазового состава подтвердили различие биохимических процессов, происходящих при холелитиазе. Применение статистических методов позволило выявить прежде не отмеченные закономерности в формировании холелитов. Выявленные отличия в аминокислотном составе свидетельствуют о специфике белковой компоненты, характерной для каждого типа холелитов. Статистическими критериями установлено, что холели-ты разного фазового состава значимо (p < 0.05) различаются по содержаниям Ala, Val, Ile, Leu, Pro, Phe, Asp и Glu. Самые низкие содержания перечисленных аминокислот определены в холестериновых желчных камнях, самые высокие — в пигментных. Особое внимание следует обратить на аминокислоту фенилаланин. Она наиболее чётко по сравнению с другими отмеченными аминокислотами различает холелиты разного фазового состава на основании результатов, полученных одномерными и многомерными статистическими методами анализа данных. Установленные зависимости могут быть использованы для решения вопросов прогнозирования типа холелитиаза и метафилактики.

Определение аминокислотного состава выполнено на аналитическом оборудовании ЦКП«Геонаука» в ИГФИЦ Коми НЦ УрО РАИ .