Анализ ассоциаций полиморфизма гена VEGF-A в позициях -2578A/C и +936C/T с разным рецепторным статусом у больных раком молочной железы

Индуцированный опухолью ангиогенез играет важную роль в прогрессии опухолевого роста и диссеминировании. Вновь сформированные кровеносные сосуды снабжают опухоль питательными веществами и кислородом, выводят продукты метаболизма клеток опухоли, генерируют паракринные стимулы, способствующие процессу метастазирования. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) – основной сигнальный белок в инициации ангиогенеза, активно продуцируемый гипоксическими опухолевыми клетками, макрофагами и другими клетками иммунной системы [5]. В предыдущие десятилетия были выделены и идентифицированы различные виды VEGF-семейства, структурно близкие между собой и являющиеся лигандами для рецепторов VEGF: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E и плацентарные факторы роста 1 и 2. VEGF-A, являясь многофункциональным цитокином и центральным регулятором физиологического и патологического ангиогенеза, участвует в процессах пролиферации, миграции и предотвращает апоптоз циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток [19].

При раке молочной железы (РМЖ) экспрессия mRNA VEGF-А увеличена в опухолевых тканях по сравнению с нормальной тканью [6]. Причем уровень высокой экспрессии mRNA VEGF-А ассоциирован с негативным рецепторным статусом, низкой степенью дифференцировки опухоли, отсутствием клинического эффекта при антиэстро-генной терапии у больных РМЖ [17]. Показано, что уровень избыточной экспрессии VEGF-А связан со снижением общей и безрецидивной выживаемости больных раком молочной железы, в том числе при ранних стадиях [7, 16, 22].

Продукция VEGF-А стимулируется множеством проангиогенных факторов, включая эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов, цитокины, а также стероидные гормоны. Функциональные полиморфные сайты, определяющие уровень продукции VEGF-A, выявлены как в области промотора 5`-нетранслируемого региона, так и в 3`-нетранслируемом регионе гена [28]. C повышенным уровнем экспрессии гена VEGF-A связывают аллель –2578С, а аллель +936Т – со сниженным уровнем продукции VEGF-A и его низким содержанием в плазме крови [14, 25].

В настоящее время выявлены ассоциации между полиморфизмом гена +936C/Т VEGF-A и риском развития рака молочной железы [8, 10, 13, 23]. Кроме того, имеются данные, что -634CC VEGF-A может рассматриваться в качестве неблагоприятного прогностического фактора, связанного с показателями безрецидивной выживаемости у больных РМЖ с гиперэкспрессией рецептора к эпидермальному фактору роста (HER-2/neu) [18]. В единичных исследованиях изучен вклад полиморфизма гена -578A/C VEGF-A в риск формирования рецидивов у эстроген/прогестерон (ER/PR) позитивных больных РМЖ [11].

Вышеизложенное свидетельствует о важной роли уровня VEGF-А в состоянии системы регуляции ангиогенеза и его связи с аллельными вариантами полиморфных участков регуляторных областей гена VEGF-А, их прогностической значимости. Целью настоящего исследования явилось изучение ассоциации функционального полиморфизма гена VEGF-A в позициях -2578 промоторного региона и +936 3` нетранслируемого региона с разным рецепторным статусом опухоли у пациенток с РМЖ.

Материалы и методы

В исследование включены 292 больных первичным операбельным РМЖ стадии Т1–4N0–3M0, которые получали комбинированное лечение в ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН в 1996–2006 гг. У всех пациентов диагноз был верифицирован морфологически. Средний возраст женщин на момент заболевания составил 51,6 года (20–79 лет). Сроки наблюдения за больными составили более 5 лет. За этот период у 14 (4,8 %) пациенток были диагностированы местные рецидивы РМЖ.

Изучение экспрессии ER, PR и HER-2/neu в ткани молочной железы проводили на парафиновых срезах иммуногистохимически с применением стрептавидин-биотинового метода. При исследовании применяли антитела фирмы «Dako» к рецепторам эстрогена (клон 1D5, RTU, мышиные), к рецепторам прогестерона (клон PgR636, RTU, мышиные), к онкопротеину c-erbB-2 (поликлональное, рабочее разведение 1:500, кроличьи). Экспрессию рецепторов к половым гормонам оценивали по 3-балльной шкале (слабая, средняя и выраженная степени).

Выделение ДНК проводили из лейкоцитов периферической крови с помощью протеиназы К и фенол-хлороформной экстракции. Генотипирование полиморфизмов С–2578A и C+936T гена VEGF-A осуществляли методом полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ анализ), с использованием специфичных праймеров [3, 12] и эндонуклеаз рестрикции Bgl II и Fae I (СибЭнзим, Новосибирск). Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.93 № 2288). На данное исследование было получено разрешение комитета по биомедицинской этике ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью пакета прикладных про- грамм «Statistica 6.0». Для проверки гипотезы о значимости различий между исследуемыми группами использовали метод двусторонней точной оценки Фишера [4]. Риск развития РМЖ у носителей различных генотипов гена VEGF-A оценивали с помощью критерия отношения шансов (OR).

Результаты и обсуждение

Результаты генотипирования исследуемых полиморфных вариантов гена VEGF-A у больных РМЖ в зависимости от экспрессии ER, PR, HER-2/neu представлены в табл. 1. Показано, что мажорный генотип гена VEGF-A –2578AA ассоциирован с прогестерон-позитивными опухолями по отношению к прогестерон-негативным (OR=1,89; p=0,041). Кроме того, при PR+ рецепторном статусе частота встречаемости комбинации гомозиготных генотипов –2578AA/+936CС была значимо выше относительно PR-негативных (OR=2,20; p=0,026).

Отмечена высокая частота встречаемости ER-негативных опухолей по сравнению с ER-положительными среди носителей комбинации гетерозиготных генотипов –2578АC/+936CТ данных полиморфизмов (OR=0,46; p=0,037). Частота встречаемости данной комбинации генотипов была выше и в группе PR-негативных пациенток по сравнению с PR+ группой, но различия не достигали статистической значимости (OR=0,49; p=0,063) (табл. 1).

Схожая направленность была определена и при изучении ассоциаций в группах больных, характеризующихся наличием или отсутствием экспрессии в опухоли рецепторов и к эстрогену и к прогестерону. Так, у больных с ER+/PR+ статусом значимо преобладала комбинация гомозиготных генотипов –2578AA/+936CС (OR=2,46; p=0,045), тогда как комбинация гетерозиготных генотипов –2578АC/+936CТ чаще выявлялась в выборке больных, негативных по экспрессии как ER, так и PR (OR=0,38; p=0,026) (табл. 2). Статистически значимых различий в распределении частот генотипов VEGF-A -2578A/C и +936C/T между пациентами с наличием и отсутствием экспрессии рецепторов к HER-2/neu установлено не было.

Для поиска взаимосвязи изучаемых полиморфизмов с клиническим течением и исходом заболевания был проведен сравнительный анализ характера распределения генотипов VEGF-A в группах пациенток с наличием и отсутствием мест-

Таблица 1

Распределение частот генотипов VEGF-A у больных РМЖ в зависимости от рецепторного статуса опухоли

VEGFA	ER+	ER-	OR (95 % CI)	PR+	PR-	OR (95 % CI)	Her2/neu +	Her2/neu -	OR (95 % CI)
С–2578A	n=191	n=101		n=173	n=116		n=48	n=186
AA	26,7 %	21,8 %	1,31 (0,71–2,41)	29,5 %	18,1 %	1,89 (1,03–3,50)*	16,7 %	27,4 %	0,53 (0,21–1,28)
AC	49,2 %	57,4 %	0,72 (0,43–1,20)	48,5 %	56,9 %	0,72 (0,43–1,18)	56,2 %	50,0 %	1,29 (0,65–2,56)
CC	24,1 %	20,8 %	1,21 (0,65–2,26)	22,0 %	25,0 %	0,84 (0,47–1,52)	27,1 %	22,6 %	1,27 (0,58–2,77)
C+936T	n=193	n=100		n=174	n=116		n=48	n=187
CC	74,1 %	65,0 %	1,54 (0,88–2,68)	73,6 %	68,1 %	1,30 (0,75–2,25)	62,5 %	72,2 %	0,64 (0,31–1,32)
CT	22,3 %	33,0 %	0,82 (0,33–1,03)	23,0 %	29,3 %	0,72 (0,41–1,27)	35,4 %	24,6 %	1,68 (0,81–3,49)
TT	3,6 %	2,0 %	1,84 (0,34–13,1)	3,4 %	2,6 %	1,35 (0,29–6,94)	2,1 %	3,2 %	0,64 (0,03–4,88)
С–2578A/ C+936T	n=190	n=99		n=171	n=115		n=47	n=185
AA/CC	21,1 %	15,1 %	1,49 (0,75–3,02)	23,4 %	12,1 %	2,20 (1,09–4,51)**	10,7 %	21,1 %	0,45 (0,14–1,28)
AA/CT	4,7 %	7,1 %	0,65 (0,21–2,02)	5,8 %	5,2 %	1,13 (0,36–3,61)	6,4 %	5,4 %	1,19 (0,25–4,99)
AA/TT	1,1 %	0 %	NS	0,6 %	0,9 %	0,67 (0,02–24,8)	0 %	1,1 %	NS
AC/CC	36,8 %	37,4 %	0,98 (0,57–1,67)	36,8 %	38,3 %	0,94 (0,56–1,58)	34,0 %	36,2 %	0,91 (0,44–1,87)
AC/CT	10,5 %	20,2 %	0,46 (0,22-0,96)***	9,9 %	18,3 %	0,49 (0,23–1,04)****	23,4 %	12,4 %	2,15 (0,89–5,14)
AC/TT	2,1 %	0 %	NS	2,3 %	0 %	NS	0 %	1,1 %	NS
CC/CC	15,8 %	12,1 %	1,36 (0,63–2,97)	12,9 %	17,4 %	0,70 (0,35–1,42)	17,0 %	14,6 %	1,20 (0,46–3,04)
CC/CT	7,4 %	6,1 %	1,23 (0,42–3,73)	7,7 %	6,1 %	1,32 (0,47–3,78)	6,4 %	7,0 %	0,90 (0,19–3,60)
CC/TT	0,5 %	2,0 %	0,26 (0,01–3,66)	0,6 %	1,7 %	0,33 (0,01–4,74)	2,1 %	1,1 %	2,01 (0,18–21,5)

Примечание: * – p=0,041, ** – p=0,026, *** – p=0,037, **** – p=0,063, NS – различия не значимы.

Таблица 2

VEGFA	ER+/PR+	ER-/PR-	OR (95 % CI)
С–2578A	n=149	n=75
AA	29,5 %	18,7 %	1,83 (0,88–3,82)
AC	49,0 %	61,3 %	0,61 (0,33–1,11)
CC	21,5 %	20,0 %	1,09 (0,52–2,31)
C+936T	n=151	n=75
CC	74,8 %	65,3 %	1,58 (0,83–3,00)
CT	21,2 %	32,0 %	0,57 (0,29–1,12)
TT	4,0 %	2,7 %	1,51 (0,26–15,6)
С–2578A/ C+936T	n=148	n=74
AA/CC	23,0 %	10,8 %	2,46 (1,02–6,15)*
AA/CT	6,1 %	8,0 %	0,73 (0,22–2,62)
AA/TT	0,7 %	0 %	NS
AC/CC	37,8 %	40,5 %	0,89 (0,49–1,64)
AC/CT	8,8 %	20,4 %	0,38 (0,16–0,91)**
AC/TT	2,7 %	0 %	NS
CC/CC	13,5 %	13,5 %	1,00 (0,41–2,45)
CC/CT	6,7 %	4,1 %	1,71 (0,42–9,98)
CC/TT	0,7 %	2,7 %	0,24 (0,01–4,81)

Примечание: * – р=0,045, ** – р=0,026, NS – различия не значимы.

Распределение частот генотипов VEGF-A у больных раком молочной железы с ER+/PR+ и ER-/PR- статусом опухоли

ных рецидивов РМЖ за 5-летний период наблюдения. Из двух исследуемых полиморфизмов гена VEGF-A и их комбинаций наиболее существенные результаты были получены для полиморфного локуса +936C/T. Так, риск развития рецидива РМЖ у носительниц мажорного генотипа +936СС оказался значительно выше, чем у носителей других генотипов (OR=1,42; p=0,021). Следует отметить, что гетерозиготный вариант +936СТ гена VEGF-А был связан с менее агрессивным течением рака молочной железы, поскольку был выявлен в 27,7 % наблюдений только у пациенток без признаков местного прогрессирования и не регистрировался ни в одном случае у больных с наличием рецидивов (табл. 3).

Наличие в опухоли рецепторов эстрогенов и прогестерона определяет не только показания к назначению эндокринной терапии у больных раком молочной железы, но и свидетельствует об относительно благоприятном прогнозе заболевания. Однако исследование дополнительных клеточных факторов, характеризующих чувствительность опухолевых клеток к терапии и определяющих адекватную тактику лечения, является весьма актуальным научным направлением. Среди возможных молекулярно-генетических маркеров особое место занимает фактор роста эндотелия сосудов. Данные исследований последних лет свидетельствуют о возможной взаимосвязи уровня VEGF-A как с содержанием рецепторов стероидных гормонов в опухоли [2], так и с эффективностью адъювантной химио/гормонотерапии и прогнозом течения заболевания больных РМЖ [1, 15]. Экспериментальные исследования подтверждают сведения о возможном участии в поддержании роста опухолевых клеток сигнальных путей, инициируемых VEGF-А, а коэкспрессия VEGF-А и его рецепторов в опухолевых клетках указывает на возможное участие этих белков в аутокринной регуляции роста опухоли [21]. Поскольку аллельные варианты гена VEGF-А влияют на уровень экспрессии соответствующих белков, они могут являться одним из факторов, определяющих индивидуальные особенности течения болезней, и их выявление может быть использовано для определения прогноза заболевания.

Проведенный нами анализ взаимосвязи двух полиморфизмов гена VEGF-А с рецепторным статусом больных РМЖ показал, что комбинация гетерозиготных вариантов –2578АC/+936CТ ассоциирована с ER-, PR- а также ER/PR-негативными

Таблица 3

Распределение частот генотипов VEGF-A у больных раком молочной железы с наличием/ отсутствием рецидива заболевания

VEGFA	Рецидив	Без рецидива	OR (95 % CI)
С–2578A	n=14	n=47
AA	35,7 %	34,0 %	1,08 (0,24–4,33)
AC	50,0 %	51,1 %	0,96 (0,25–3,69)
CC	14,3 %	14,9 %	0,95 (0,09–5,99)
C+936T	n=14	n=47
CC	100 %	70,2 %	1,42 (1,18–1,72)*
CT	0 %	27,6 %	0,00 (0,00–0,95)**
TT	0 %	2,1 %	NS
С–2578A/ C+936T	n=14	n=47
AA/CC	35,7 %	23,4 %	1,82 (0,39–7,64)
AA/CT	0 %	10,6 %	0,00 (0,00–3,71)
AA/TT	0 %	0 %	NS
AC/CC	50,0 %	38,3 %	1,61 (0,42–6,28)
AC/CT	0 %	10,6 %	0,00 (0,00–3,71)
AC/TT	0 %	2,1 %	NS
CC/CC	14,3 %	8,5 %	1,79 (0,14–14,2)
CC/CT	0 %	6,4 %	NS
CC/TT	0 %	0 %	NS

Примечание: * – p=0,021, ** – p=0,027, NS – различия не значимы.

опухолями. Однако в исследованиях Wehrschuetz et al. (2009) не выявлено ассоциаций между полиморфизмом в позиции С+936Т 3`-нетранслируемого региона VEGF-A и рецепторным статусом [29]. По данным Rodrigues et al. (2012), наличие +936CТ + TT VEGF-A генотипов ассоциируется со снижением риска развития РМЖ [23]. Низкий уровень экспрессии VEGF-A при наличии аллеля А, по-видимому, обеспечивает протективное действие +936CТ и +936TТ генотипов в плане предрасположенности к возникновению РМЖ и сопряжен с более благоприятным клиническим течением заболевания.

Напротив, для PR-положительных пациентов нами выявлено повышение частоты встречаемости гомозиготного варианта –2578АА, а носительство комбинации гомозиготных генотипов 2578АA/+936СС ассоциировано с ER+/PR+ опухолями. В настоящее время в литературе не существует единого мнения о роли полиморфизма С–2578A гена VEGF-A в оценке риска развития РМЖ, также недостаточно изучен вопрос о его взаимосвязи с показателями гормонозависимости опухоли – PR и ER [9, 24, 27]. Тем не менее рядом исследований показано, что носительство -2578CC аллельного варианта, сопряженного с высоким уровнем продукции VEGF-A, ассоциировано как с ER+/PR+ статусом, так и низкими показателями безрецидивной выживаемости у больных РМЖ [11, 26]. Это, видимо, позволяет, несмотря на достаточно благоприятные характеристики ER+/ PR+ пациентов, выделить среди них подгруппу с неблагоприятным исходом. Для +936СС варианта обнаружена значимая взаимосвязь не только с ER/ PR-позитивным статусом, но и со степенью дифференцировки опухоли [20]. Следует отметить, что противоречивость имеющихся данных может быть связана как с различным объемом исследуемых выборок, так и их популяционными особенностями.

Нами определена четкая связь +936СС генотипа с риском развития рецидивов РМЖ. Кроме того, показано, что носительство гетерозиготного +936СT генотипа в большей мере ассоциировано c безрецидивным течением заболевания. Учитывая, что высокий уровень экспрессии VEGF-А связывают с высоким риском рецидива РМЖ и снижением выживаемости [26], можно предположить вклад в развитие этого вида прогрессии именно генотипа

+936СС, определяющего высокий уровень экспрессии белкового продукта.

Таким образом, проведенное исследование указывает на то, что полиморфизм гена VEGF-A в позициях -2578A/C и +936C/T является одним из факторов, определяющих индивидуальные особенности течения РМЖ, и исследование полиморфных вариантов гена VEGF-A может быть использовано для определения прогноза заболевания. Одновременный учет уровня экспрессии стероидных рецепторов в опухолевых тканях, генотипа пациентки по полиморфным участкам генов факторов регуляции ангиогенеза при дальнейшем клиническом анализе позволит определить в пределах отдельных молекулярных подтипов РМЖ подгруппы с наиболее агрессивным течением заболевания и неблагоприятным исходом.

Работа выполнена в рамках интеграционного научного проекта СО РАМН «Молекулярно-генетические механизмы формирования и прогрессии рака молочной железы: разработка критериев риска, прогноза клинического течения и чувствительности к химиотерапии на основании выявления информативных маркеров опухоли и организма» 2006–2008 гг.