Анализ ассоциаций SNP (400 с > а) в гене IGF1 с показателями размера и массы у стерляди (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758)

Для успешного развития товарной аквакультуры необходимо системное научное сопровождение отрасли, в том числе развитие ДНК-технологий. Важным шагом в этом служит поиск полиморфных локусов в генах-кандидатах и проведение ассоциативных исследований между различными генотипами и показателями продуктивности, а также использование полученных результатов в маркерной селекции (marker assisted selection, MAS) объектов аквакультуры.

У большинства изученных рыб от 40 до 60 % от общей массы тела приходится на скелетные мышцы (1), которые в основном представляют собой белые мышечные волокна, составляющие съедобную часть рыбы (2, 3). У костных рыб рост и развитие скелетных мышц зависит главным образом от доступности питательных веществ, которые модулируют ось GH/IGF1 (4, 5).

Инсулиноподобный фактор роста 1 (insulin-like growth factor 1, IGF1) — это митогенный полипептид, который принимает участие в регуляции развития и соматического роста позвоночных, а также играет ключевую роль как основной негативный регулятор выработки гормона роста (6, 7). IGF1 вовлечен в регуляцию белкового, липидного, углеводного и минерального обмена в клетках, дифференцировку и пролиферацию клеток и, в конечном счете, влияет на рост организма (8-10). Экспрессия мРНК у рыб обнаружена в желудочно-кишечном тракте, скелетных мышцах, жабрах, половых железах, почках, поджелудочной железе, селезенке, но наибольшая экспрессия наблюдается в печени (11-14). Печень — основной источник циркулирующего IGF1 (cIGF1), хотя некоторое количество cIGF1 поступает из других тканей, включая мышцы (15).

В исследованиях F. Chauvign с соавт. (16) на радужной форели установлено, что экспрессия мРНК IGF1 в мышцах резко повышается в ответ на возобновление питания. Следовательно, IGF1 идентифицирован как многообещающий ген-кандидат, участвующий в сигнальной системе клеточного уровня, которая регулирует рост миотомальных мышц рыб. Данные M.E. Picha с соавт. (17), B.R. Beckman с соавт. (18), C. Duan (19), D.A. Larsen с соавт. (20), B.K. Fox с соавт. (21) подтверждают, что содержание IGF1 в плазме или количество его мРНК в тканях положительно коррелируют со скоростью роста у различных видов рыб.

Было выполнено много исследований по поиску полиморфизмов в гене IGF1 и оценке его связи с показателями продуктивности объектов товарной аквакультуры (22). Выявленные однонуклеотидные полиморфизмы и микросателлиты, ассоциированные с показателями роста, предложено использовать в маркерной селекции рыб (23-26). Однако на стерляди подобные работы еще не проводились.

Стерлядь (Acipenser ruthenus, Linnaeus, 1758) — распространенный представитель осетровых видов рыб, известный своим относительно небольшим размером тела и широким ареалом по сравнению с другими осетровыми (27). Вид характеризуется ранним половым созреванием и высокоадаптивен к различным условиям содержания в аквакультуре (28). В настоящее время естественные популяции стерляди имеют охранный статус исчезающего вида (29). Восстановление и поддержание их численности в современных условиях возможно за счет развития аквакультуры. Стерлядь разводится в прудах, бассейнах и специализированных системах замкнутого водоснабжения (30). В связи с развитием товарной аквакультуры возрастает спрос на разведение стерляди, имеющей высокую скорость роста.

Рост рыб — один из наиболее важных экономических показателей в аквакультуре (31, 32). Однако у стерляди вызванная относительно длинным интервалом смены поколений изменчивость затрудняет достижение удовлетворительного генетического улучшения показателей роста при традиционной селекции. Использование полиморфизмов функциональных генов в качестве генетических маркеров — эффективный инструмент для решения селекционных задач в аквакультуре (33, 34).

В представленной работе мы впервые секвенировали последовательности кДНК паралогичных генов инсулиноподобного фактора роста 1 стерляди и выявили на 7-й хромосоме несинонимичный полиморфизм (400 С > А) в 1-м экзоне и синонимичный SNP (479 С > А) — во 2-м экзоне, а также исследовали влияние генотипа по SNP (400 С > А) гена IGF1 на размер и массу у стерляди.

Нашей целью было изучение полиморфизма кодирующей части гена IGF1 с помощью секвенирования кДНК, идентификация SNP и выявление ассоциаций между генотипами и размерно-массовыми показателями стерляди.

Методика. Исследования проводили на сухонской ( n = 58) и окской ( n = 44) популяциях стерляди, выращиваемой в установке замкнутого водоснабжения (УЗВ) (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023 год). Окская популяция стерляди была привезена с Можайского производственно-экспериментального рыбоводного завода (Можайский городской округ, Московская обл.), сухонская — получена в ООО РТФ «Диана» (Ка-дуйский р-н, Вологодская обл.). В УЗВ периодически контролировали температуру воды (20-22 ° C), содержание аммония (NH 4 ) (< 0,5 мг/л), нитритов (NO 2 ) (0,1 мг/л), нитратов (NO 3 ) (20 мг/л), рН (7,2-7,6), содержание аммиака (NH 3 ) (< 0,01мг/л) и кислорода (О 2 ) (9,8-11,0 мг/л), чтобы поддерживать качество воды оптимальным для разведения рыбы.

Для проведения ассоциативных исследований было выполнено чипирование рыбы и создана база данных, в которую заносили результаты бонитировки. Измерения проводились одним оператором по 11 морфометрическим признакам (35): общая длина, длина тела до конца средних лучей, длина головы, наибольшая высота тела, длина хвостового стебля, пекто-вентральное расстояние, вентроанальное расстояние, наибольший обхват тела, наибольшая толщина тела, обхват хвостового стебля, высота хвостового стебля, масса тела.

Тотальную РНК выделяли из фрагментов печени, мозга, мышцы, сердца и крови с помощью комплекта реагентов РНК-ЭКСТРАН (НПО «Синтол», Россия) согласно инструкции производителя. Синтез первой цепи ДНК на РНК-матрице проводили с использованием набора реагентов для обратной транскрипции (НПО «Синтол», Россия) по методике производителя. Геномную ДНК экстрагировали из консервированных в спирте фрагментов плавников с использованием набора для выделения геномной ДНК ДНК-ЭКСТРАН (НПО «Синтол», Россия).

Концентрацию РНК оценивали cпектрофотометрически (NanoDrop 8000, «Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). ПЦР выполняли на амплифи-каторе Thermal Cycler SimpliAmp («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США) в следующем режиме: 10 мин при 94 ° С (первичная денатурация); 30 с при 95 ° С (денатурация), 40 с при 62 ° С (отжиг праймеров на ДНК-матрице), 35 с при 72 ° С (элонгацию цепей) (40 циклов); 5 мин при 72 ° С (финальная 682

элонгация). Состав реакционной смеси на 20 мкл был следующим: 2 мкл 10½ Taq Turbo-буфера (ЗАО «Евроген», Россия), 2 мкл 2 мМ раствора dNTPs, 1 мкл 10 мМ смеси праймеров, 1 ед. Smart Таq-полимеразы (ЗАО «Диалат Лтд.», Россия). Добавляли ~ 50-100 нг исследуемой кДНК, до конечного объема доводили деионизированной водой. В реакции использовали следующие праймеры:

Ген	Хромосома	Нуклеотидная последовательность	Температура \ отжига, ° C	Длина ампликона, п.н.
IGF1	7-я	F: 5´-TATTTTGCTGGTCTTTGTAGTTCTGG-3´	63	520
		R: 5´-CTAAATCCGGTAGTTCCTGTTGC-3´	63
IGF1	14-я	F: 5´-ATTGTGCTGCTCTTTGTAGTTTAGG-3´	63	526
		R: 5´-CTACATCCGGTAGTTCCTGTTGC-3´	65

Детекцию результатов ПЦР осуществляли в 1-2 % агарозном геле с использованием колориметрической системы гель-документирования Uvitec FireReader V10 imaging System («Cleaver Scientific», Великобритания). Качественные образцы использовали в дальнейшей работе.

Эталонные последовательности были отобраны в базе данных GenBank (NCBI). Праймеры подбирали с помощью онлайн программы Олигокалькулятор (OligoCalk) и BioEdit v7.7.1.0 («Tom Hall», США). Реакционные смеси очищали с использованием набора Cleanup Mini (ЗАО «Евроген», Россия) и набора реагентов для очистки сиквенсных смесей SQ-Magno-Clean (ООО «НПФ «ЭПИТОП», Россия). Последовательности ДНК определяли секвенированием по Сэнгеру на генетическом анализаторе Нанофор 05 (НПО «Синтол», Россия) с использованием набора GenSeq (НПО «Синтол», Россия) согласно инструкциям производителя.

Методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на приборе QuantStudio 5 («Thermo Fisher Scientific», США) определяли полиморфизм гена (С ^ A в позиции 400 Accession No. XM_034024781.3). Работу с полученными нуклеотидными последовательностями генов выполняли с помощью специального программного обеспечения Mega7 (36). Третичную структуру белка моделировали с использованием интегрированного сервера прогнозирования структуры и функций белка IntFOLD (the IntFOLD Integrated Protein Structure and Function Prediction Server) (37).

Влияние полиморфизма оценивали, сравнивая показатели роста и развития ( M ±SEM) 102 особей разных генотипов по локусу 400 С > А с использованием t -критерия Стьюдента, а также с применением однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа в программе STATISTICA 10 («StatSoft, Inc.», США).

Результаты. Acipenseriformes пережили несколько этапов полиплои-дизации, что привело к появлению кариотипов, включающих от ~ 120 хромосом у некоторых видов до ~ 360 хромосом у видов, которые считаются додекаплоидными (38). По эволюционной шкале плоидности Acipenser ruth-enus относиться к тетраплоидным видам (4 n ) (39), поэтому система IGF у стерляди дополнительно осложнена присутствием паралогичных генов. При этом по функциональной шкале вид относят к диплоидным (2 n ) (40).

У стерляди ген IGF1 представлен двумя паралогами, расположенными на 7-й и 14-й хромосомах. Поэтому для проведения полимеразной цепной реакции были подобраны специфические праймеры для каждого паралогичного гена, чтобы секвенировать каждую последовательность отдельно (рис. 1). Эталонной последовательностью гена IGF1 для 7-й хромосомы была выбрана XM_034024781.3 (LOC117414927), для 14-й хромосомы — XM_034032300.3.

Рис. 1. Фрагмент выравнивания эталонных последовательностей гена IGF1 стерляди ( Acipenser uthenus , Linnaeus, 1758): верхняя последовательность — 7-я хромосома, нижняя — 14-я хромосома). Скриншот окна программы BioEdit.

Рис. 2. Электрофореграмма результатов ПЦР-амплификации гена IGF1 стерляди ( Acipenser ruthenus , Linnaeus, 1758): М — ДНК-маркер 50 bp («Fermentas», Литва), 1 — печень (рыба ¹ 1), 2 — мозг (рыба ¹ 1), 3 — мышца (рыба ¹ 1), 4 — сердце (рыба ¹ 1), 5 — печень (рыба ¹ 2), 6 — кровь (рыба ¹ 2), 7 — мозг (рыба ¹ 2), 8 — мышца (рыба ¹ 2), 9 — сердце (рыба ¹ 2).

РНК выделяли из разных органов и тканей (печень, мозг, мышца, сердце, кровь). После выделения и обратной транскрипции получали кДНК и проводили ПЦР. По результатам анализа электрофореграммы продуктов амплификации гена IGF1 (рис. 2), наибольшее количество ПЦР-продукта было получено с РНК, выделенной из печени стерляди. В иссле-

дованиях на нескольких видах рыб установлено, что именно в печени наблюдалась самая высокая экспрессия гена IGF1 (11, 12). Поэтому для получения ПЦР-продукта хорошего качества и дальнейшего секвенирования

мы использовали кДНК на основе РНК из печени (рис. 3).

Рис. 3. Электрофореграмма результатов ПЦР-амплификации гена IGF1 стерляди ( Acipenser ruth-enus , Linnaeus, 1758): М — маркер молекулярных масс (DNA Ladder 100+ bp, ЗАО «Евроген», Россия), 1-13 — ПЦР-продукт гена IGF1 , расположенного на 7-й хромосоме (520 п.н.).

При выравнивании нуклеотидных последовательностей гена IGF1 , расположенного на 7-й хромосоме, были идентифицированы два SNPs. Положения SNPs были названы относительно начала эталонной последовательности XM_034024781.3. Мы обнаружили несинонимичную мутацию в позиции 400 п.н. (1-й экзон), где цитозин замещается на аденин (400 С > А), а также cинонимичную мутацию, не приводящую к изменению аминокислоты лейцин (Leu → Leu) в позиции 479 G > A (2-й экзон). При выравнивании нуклеотидных последовательностей гена IGF1 на 14-й хромосоме в исследованных фрагментах замен мы не выявили.

Рамка считывания содержала 537 п.н. и кодировала белок IGF1, в состав которого входят 178 аминокислот. В результате несинонимичной замены 400 С > А триплет ССТ замещался на САТ, что приводило к замещению аминокислоты пролина на гистидин (Pro → His).

На рисунке 4 показаны модели третичной структуры белка IGF1 с аминокислотой пролин и гистидин. Различие пространственной третичной структуры белка IGF1 можно объяснить тем, что пролин относится к классу аминокислот с неполярными R-группами, а гистидин — к классу с положительно заряженными полярными R-группами.

Рис. 4. Третичная структура белка IGF1 стерляди ( Aci-penser ruthenus , Linnaeus, 1758), в состав которого входит аминокислота пролин (слева) или аминокислота гистидин (справа) .

На фрагментах хроматограмм последовательностей гена IGF1 стерляди (рис. 5) в однонуклеотидном полиморфизме 400 С > А было четко видно наличие генотипов СС , АС и АА , в SNP 479 G > A — AA , AG и GG .

Для массового тестирования стерляди и дальнейших ассоциативных исследований была разработана тест- система по определению генотипов по SNP 400 С > А как наиболее перспективному. Известно, что полиморфизмы в промоторной области и мис-сенс-мутации в кодирующих областях с большей вероятностью имеют пря- мую связь с характеристиками, на которые влияет ген-кандидат, чем интронные полиморфизмы или молчащие мутации в кодирующей области (41). Методом ПЦР-РВ мы генотипировали 102 особи стерляди, принадлежащие к окской и сухонской популяциям.

Рис. 5. Фрагменты хроматограмм последовательностей гена IGF1 стерляди ( Acipenser ruthenus , Linnaeus, 1758), расположенного на 7-й хромосоме: А — SNP (400 С > А), Б — SNP (479 G > A).

При оценке генетической структуры популяций стерляди по гену IGF1 (400 С > А, 7-я хромосома) наибольшее количество гомозигот АА и СС было выявлено в окской популяции (соответственно 38,6 и 11,4 %), а гетерозигот — в сухонской (56,9 %) (табл. 1). Частота аллелей А и С между группами различалась незначительно. Нарушения генетического равновесия не наблюдалось, значение χ ² варьировало от 0,284 до 3,478.

1. Генетическая структура популяций стерляди ( Acipenser ruthenus , Linnaeus, 1758) по гену IGF1 (400 С >  А, 7-я хромосома) (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023 год)

Популяция	n	Частота генотипов, %			Частота аллелей		χ 2
		АА	АС	СС	А	С
Сухонская	58	36,2	56,9	6,9	0,647	0,353	3,478
Окская	44	38,6	50,0	11,4	0,636	0,364	0,284
Всего	102	37,3	53,9	8,8	0,642	0,358	3,062

При сравнении показателей продуктивности стерляди, принадлежа- щей к разным генотипам по локусу IGF1 400 С > А (табл. 2), установлено, что носители генотипа СС имели достоверно большую (р < 0,05) массу тела, общую длину тела, пектровентральное расстояние и обхват тела, чем рыба с генотипом АС. При этом следует отметить, что частота генотипа СС в исследуемой популяции была наименьшей (8,8 %). Наши результаты согласуются с данными других авторов, полученных на разных видах рыбы. У атлантического лосося (Salmo salar) установлено, что гомозиготные генотипы TT (SNP1, g.5763G > T) и АА (SNP3, g.4671A > C) имели наименьшую частоту встречаемости (соответственно 14,5 и 1,6 %) и были достоверно связаны (р < 0,05) с несколькими весовыми признаками (42). X.H. Li с соавт. (43) обнаружили, что большеротый окунь (Micropterus salmoides) с генотипом AA (частота 12,5 %) имел достоверно большую массу тела и наибольшую ширину тела, чем рыбы с генотипами AB или BB. В популяции обыкновенного карпа (Cyprinus carpio) установлено, что локус g.7627T > A был достоверно связан с массой и длиной тела. У рыб с генотипом AA средняя масса тела была на 5,9 % выше, а средняя длина тела — на 2,8 % больше, чем у особей с генотипом ТТ (34). Согласно нашим результатам, стерлядь с генотипом СС имела на 14,6 % большую массу тела и на 5,2 % — общую длину, чем рыба с генотипом АС.

• 2.    Продуктивные показатели стерляди ( Acipenser ruthenus, Linnaeus, 1758) в среднем по двум популяциям (сухонской и окской) в зависимости от генотипа по гену IGF1, расположенному на 7-й хромосоме (400 С > А) ( M ±SEM; ФГБНУ ФИЦ ВиЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023 год)

• 3.    Продуктивные показатели стерляди ( Acipenser ruthenus , Linnaeus, 1758) сухонской и окской популяций в зависимости от генотипа по гену IGF1, расположенному на 7-й хромосоме (400 С > А) ( M ±SEM; ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023 год)

  Показатель	Генотип
  	АА	АС	CC
  Окская Число рыб, n	популяция 17	(Можайский ПЭРЗ) 22	5
  Масса тела, г	462±23,0	447±16,2	509±27,1
  Общая длина, cм	45,2±0,69	45,0±0,51	47,4±1,11
  Длина тела до конца средних лучей, cм	38,1±0,46	37,5±0,46	39,2±0,78
  Пектровентральное расстояние, cм	15,5±0,26	15,2±0,26	16,0±0,27*
  Вектроанальное расстояние, cм	6,1±0,11	6,2±0,15	6,3±0,30
  Наибольший обхват тела, cм	16,6±0,38	16,2±0,25	17,0±0,30
  Наибольшая высота тела, cм	5,5±0,14	5,4±0,10	5,8±0,16
  Наибольшая толщина тела, cм	4,3±0,11	4,2±0,08	4,4±0,12
  Сухонска Число рыб, n	я популяци 21	я (ООО РТФ «Диана») 33	4
  Масса тела, г	405±20,3	387±16,2	445±58,5

• 4.    Результаты однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа для показателей роста и развития стерляди ( Acipenser ruthenus , Linnaeus, 1758) разных генотипов по гену IGF1 , расположенному на 7-й хромосоме (400 С > А) (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023 год)

Показатель	Генотип
	АА ( n = 38)	АС ( n = 55)	CC ( n = 9)
Масса тела, г	430,1±15,74	410,8±12,25	480,6±30,03*
Общая длина, cм	45,9±0,49	45,1±0,38	47,6±1,16*
Длина тела до конца средних лучей, cм	38,1±0,35	37,3±0,33	39,1±0,98
Пектровентральное расстояние, cм	15,2±0,19	14,8±0,16	15,8±0,33*
Вектроанальное расстояние, cм	5,8±0,12	5,9±0,10	6,2±0,24
Наибольший обхват тела, cм	16,0±0,26	15,7±0,19	16,6±0,35*
Наибольшая высота тела, cм	5,4±0,09	5,3±0,07	5,6±0,15
Наибольшая толщина тела, cм	4,1±0,07	4,0±0,05	4,1±0,04

* Различия между показателями у генотипа CC и генотипа AC статистически значимы при р < 0,05.

Также мы сравнили показатели роста и развития стерляди из окской и сухонской популяций (табл. 3). В целом сохранялась та же тенденция: носители генотипа СС имели большие значения по промерам и массе, чем гетерозиготы АС , однако достоверные различия были установлены только у стерляди окской популяции по пектровентральному расстоянию (р < 0,05).

		Продолжение таблицы 3
Общая длина, cм	46,5±0,68	45,1±0,56	47,9±2,45
Длина тела до конца средних лучей, cм	38,1±0,51	37,1±0,45	38,9±2,16
Пектровентральное расстояние, cм	14,9±0,28	14,6±0,19	15,5±0,68
Вектроанальное расстояние, cм	5,6±0,18	5,6±0,11	6,0±0,41
Наибольший обхват тела, cм	15,6±0,33	15,3±0,26	16,2±0,69
Наибольшая высота тела, cм	5,3±0,11	5,2±0,09	5,4±0,24
Наибольшая толщина тела, cм	4,0±0,08	3,9±0,06	4,0±0,26

* Различия между показателями у генотипа CC и генотипа AC статистически значимы при р < 0,05.

С использованием однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа было изучено влияние фактора «генотип» по локусу IGF1 (400 С > А), а также факторов «генотип» по локусу IGF1 (400 С > А) и «принадлежность к популяции» (окская и сухонская) на размерно-весовые показатели стерляди (табл. 4).

Показатель

Однофакторный         Двухфакторный F □ p □ R2    F □ p □ R2

Масса тела Общая длина Длина тела до конца средних лучей Длина головы Пектовентральное расстояние Вентроанальное расстояние Наибольший обхват тела Обхват хвостового стебля Наибольшая толщина тела

2,29      0,106       2,5      3,18*      0,011       9,7 3,10*     0,050       4,0      1,54       0,184       2,6 2,82      0,064       3,5       1,18       0,326       0,9 0,29      0,748       1,4      2,81*      0,021       8,2 2,81       0,066       3,5      2,26       0,054       5,9 0,92      0,404       0,2      3,79**     0,003      12,1 1,88       0,157       1,7      2,96*      0,016       8,9 0,85      0,432       0,3      2,66*      0,027       7,6 1,51       0,226       1,0      2,91*      0,017       8,7

Статистически значимо соответственно при р < 0,05 и р < 0,01.

Однофакторный дисперсионный анализ показал статистически значимое влияние генотипа по полиморфизму 400 С > А гена IGF1 только на общую длину стерляди (р < 0,05). Двухфакторный дисперсионный анализ выявил достоверное влияние генотипа и принадлежности к популяции на массу тела (р < 0,05), длину головы (р < 0,05), вентроанальное расстояние (р < 0,01), наибольший обхват тела (р < 0,05), обхват хвостового стебля (р < 0,05) и наибольшую толщину тела (р < 0,05) у исследуемых рыб.

Таким образом, обнаружены два однонуклеотидных полиморфизма в кодирующей области гена инсулиноподобного фактора роста 1 у стерляди из сухонской и окской популяций — SNP 400 С > А и SNP 479 G > A. Несинонимичная мутация в позиции 400 С > А приводит к замене аминокислоты пролина на гистидин и, как следствие, к изменению пространственной структуры белка. Ассоциативный анализ выявил наличие достоверного влияния генотипа по SNP 400 С > А на размеры и массу стерляди. Полученные результаты в целом указывают на потенциал использования полиморфизма гена IGF1 для генетического улучшения аквакультурной стерляди, однако необходимо увеличить число SNPs и проанализировать как отдельные полиморфизмы, так и комплексные генотипы, а также выполнить аналогичные исследования на расширенном поголовье стерляди.