Анализ цитотоксичности гуминовых веществ пелоидов

С момента открытия гуминовых веществ Францем Карлом Ахардом прошло 225 лет. За этот период был накоплен значительный материал по структуре и свойствам этих веществ, была определена их биологическая значимость для организма животных и человека. Уже в 1988 г. доктор медицины С.А. Виссер в своем выступлении на съезде Международного гуминового общества в Севилье (Испания) докладывал о возможности эффективного наружного и внутреннего применения гуминовых веществ при лечении ряда тяжелых заболеваний. На сегодняшний день доказаны многочисленные терапевтические эффекты гуминовых веществ: противовоспалительный, обезболивающий, противоотечный, гиперемический, антиревматический, антиоксидантный, антимикробный, противоопухолевый и другие. Но до сих пор в Российской Федерации не зарегистрировано в качестве лекарственного средства ни одного препарата, содержащего гуминовые вещества. В первую очередь это связано с их сложной нестехиометрической структурой. Данная проблема отягощается тем, что до сих пор не проведены исследования по оценки лекарственной цитотоксичности гуминовых веществ.

Цель исследования: оценка цитотоксичности природных высокомолекулярных органических соединений – гуминовых веществ пелоидов.

Объект исследования: фракции гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей (пелоидов): гуминовые (ГК), гиматомелановые (ГМК), фульвовые (ФК)

и гумусовые (ГсК) кислоты, которые различаются технологией извлечения из нативной грязи [1].

Гуминовые вещества относятся к поли-молекулярным полидисперсным соединениям нестехиометрического состава, имеющим стохастическое строение и включающим в свою структуру большинство известных функциональных групп органических соединений: карбонильные, спиртовые, карбоксильные, аминные и другие (рис. 1) [2].

Рис. 1. Структурный фрагмент молекулы гуминовых кислот (по Schulten, 1994)

Для количественного описания структуры изучаемых в работе гуминовых веществ пелоидов можно использовать набор параметров, включающих в себя атомные отношения конституционных элементов и их распределение между основными структурными фрагментами (табл. 1).

Материалы и методы. В данной работе использовался МТТ-тест (MTT-assay), широко применяемый в клинико-лабораторных и экспериментальных исследованиях для оценки клеточной и лекарственной цитотоксичности. Данный тест основан на способности группы ферментов, катализирующих окислительновосстановительные реакции – митохондриальных и цитоплазматических дегидрогеназ живых метаболически активных клеток, конвертировать и восстанавливать производные тетразолия – бесцветный     водорастворимый     3-(4,5- диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразо-лиум бромид (синоним МТТ, желтый тетразол) в формазан (рис. 2) [3].

Таблица 1. Элементный состав, степень окисленности, бензоидности и коэффициенты экстинкции гуминовых веществ пелоидов

Рис. 2. Реакция перехода желтого тетразола (МТТ) в формазан, под действием митохондриальной редуктазы

Формазан кристаллизуется внутри клетки в виде фиолетово-голубых кристаллов. Перевод кристаллов формазана в раствор осуществляют с помощью подходящих органических растворителей, таких как, диметилсульфоксид (ДМСО), додецилсульфат натрия или изопропанол. Последующая спектрофотометрия этого раствора позволяет точно сопоставить изменение оптической плотности по отношению к контролю с изменением количества жизнеспособных клеток, а в цитотоксических исследованиях оценить специфическую гибель клеток, индуцированную тем или иным цитотоксическим агентом [4]. В качестве тест-культуры служили человеческие клетки Т-лимфомы линии KE37.1-IIIB. Клетки культивировали в модифицированной среде Dulbecco's Eagle's Medium (DME), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 4мМ L-глютамина, 1,5 г/л бикарбоната натрия, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при 37оС во влажной атмосфере с 5% СО2 [5]. Оценка гибели клеток линии KE37.1-IIIB, индуцированной гуминовыми веществами, проводилась с помощью ИФА-ридера Tecan Infinite M200. Для этого в лунки 96-луночной плоскодонной культуральной планшеты вносили по 100 мкл суспензии клеток (~105 кл/мл) и 100 мкл исследуемой концентрации (с учетом разбавления в лунке) препарата гуминовых веществ. Планшеты инкубировали в течение 24 часов. За 4 часа до окончания инкубационного периода вносили МТТ. МТТ-тест проводили по методике Niks M. и Otto M. [5]. В каждую лунку планшеты с клеточными суспензиями вносили 20 мкл раствора МТТ (5 г/л) и инкубировали на протяжении 4 ч при 37оС в темноте во влажной атмосфере c 5% СО2. По окончании инкубации супернатант осторожно удаляли с помощью планшетного насоса, а в каждую лунку добавляли по 200 мкл ДМСО. Осадок ресуспендировали и 10 мин инкубировали в темноте при комнатной температуре. Показания оптической плотности считывали на ИФА-ридере Tecan Infinite M200 при длине волны 570 нм. Гибель Т-лимфомных клеток рассчитывали путем сравнения оптической плотности контроля среды, принятой за 100%, с оптической плотностью в опытных пробах. Цитотоксичность исследуемое вещество проявляет, если его процентный показатель оптической плотности меньше 70%. Если показатель оптической плотности превышает 70%, то данное вещество не проявляет выраженной токсичности на культуру клеток.

Результаты. МТТ-тест показал, что все исследуемые фракции гуминовых веществ пе-лоидов в исследуемом интервале концентраций от 1% до 0,00125% не оказывают выраженную цитотоксичность к клеткам Т-лимфомы человека линии KE37.1-IIIB (рис. 3). Кроме этого, в ходе эксперимента было выявлено, что гуминовые вещества пелоидов усиливают протекторную функцию исследуемой тест-культуры, так как их показатели оптической плотности превышают показатели контроля. Наибольшим протекторным эффектом обладает фракция гиматомелановых кислот пелоидов.

Рис. 3. Диаграмма показателей МТТ теста фракций гуминовых веществ пелоидов

Выводы: гуминовые, гиматомелановые, фульвовые и гумусовые кислоты пелоидов не обладают выраженной цитотоксичностью в интервале исследуемых концентраций, что дает возможность создания на их основе лекарственных фармако- и химиотерапевтических препаратов различного назначения. Отсутствие выраженной цитотоксичности гуминовых веществ пе-лоидов может быть обусловлена тем, что формирование живых систем организмов в процессе эволюции происходило именно в гуминовом фоне. Естественный гуминовый фон не оказывает неблагоприятного влияния на организм человека, а выполняет защитную функцию, выступая в качестве совокупности экзогенных антиоксидантных и протективных факторов.

Работа выполнена при поддержке гранта Международного гуминового общества (IHSS) на базе Институтов вирусологии и экологической химии (Institut für Ökologische Chemie (IOEC), Institut für Vi-rologie (VIRO)) Гельмгольц-Центра Мюнхен (Helmholtz Zentrum München) в 2011 г.