Анализ генетического разнообразия, структуры и дифференциации популяций Pinus sylvestris L. на Урале

Генетическое разнообразие важно для выживания видов и играет решающую роль в их сохранении [Spielman, Brook, Frankham, 2004; O'Grady et al., 2006; Frankham, 2012]. Для поддержания адаптивного потенциала необходимо сохранять аллельное разнообразие популяций, включая как типичные, так и специфичные аллели [Потокина, Александрова, 2008].

Хвойные леса составляют основу бореальных экосистем и имеют огромное экономическое значение. Они оказывают локальное и глобальное влияние на экосистемы, являясь важной частью регулирования водного стока и сохранения почв, важнейшим звеном в круговороте углерода и средством очистки атмосферного воздуха от загрязнений [Högberg et al., 2001; Pan et al., 2011; Lindén et al., 2014]. Кроме этого, ткани хвойных растений богаты биологически активными веществами (BAC, Biologically Active Compounds), такими как терпеноиды, стероиды, алкалоиды, флавоноиды, комплексы полисахаридов (холоцеллюлоза) и прочее, являющиеся перспективным сырьем для фармацевтической промышленности [Dering et al., 2017; Liu et al., 2019].

Сосна обыкновенная ( Pinus sylvestris L.) – вторая по распространенности хвойная порода в мире, имеющая большое экономическое и экологическое значение. Сосновые леса широко распространены в мире и, в частности, в Северном полушарии, что делает сосну обыкновенную одной из важнейших лесообразующих пород [Floran, Sestras, Gil, 2011]. Современный ареал этого вида является результатом событий повторной колонизации и послеледникового сокращения некогда большего ареала распространения [Hebda, Wójkiewicz, Wachowiak, 2017; Toth et al., 2017]. P. sylvestris — вид, толерантный к широкому спектру экологических условий окружающей среды и играющий важную экономическую и экологическую роль в лесных экосистемах Европы [Hogberg et al., 2001; Lindén et al., 2014]. Молекулярногенетические исследования P. sylvestris проводились как в Европе, так и в России [Floran, Sestras, Gil, 2011; Видякин и др., 2012; Санников, Петрова, 2012; Pazouki et al., 2016; Hebda, Wójkiewicz, Wachowiak, 2017; Toth et al., 2017; Chertov et al., 2022; Kavaliauskas, Danusevičius, Baliuckas, 2022]. С использованием аллозимного анализа были изучены полиморфизм и дифференциация популяций P. sylvestris, филогео-графическая структура, а также установлены плейстоценовые рефугиумы вида [Санников, Петрова, 2012]. Результаты анализа митохондриальных маркеров свидетельствуют о том, что на всем пространстве от востока Восточно-Европейской равнины и по крайней мере до реки Енисей, вид практически генетически однороден [Видякин и др., 2012]. На Северном и Среднем Урале молекулярно-генетические исследования P. sylvestris носят фрагментарный характер и велись в области молекулярно-генетической идентификации популяций [Боронникова и др., 2018; Пришнивская и др., 2019; Чертов и др., 2020].

Молекулярно-генетический анализ генетического разнообразия древесных видов растений с использованием ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) является простым и доступным ПЦР-методом анализа полиморфизма ДНК [Zietkiewicz, Rafalski, Labuda, 1994]. Из-за большого числа копий микросателлитных последовательностей и их большого числа в геномах эукариот использование последовательностей SSR (Simple Sequence Repeats) в качестве праймера для метода фингерпринтинга ДНК на основе ПЦР удобно и эффективно [Kalendar et al., 2019; Kalendar, Muterko, Boronnikova, 2021].

Сосна обыкновенная широко используется в хозяйственной деятельности, ее древесина активно заготавливается. Для составления программ рационального использования лесных ресурсов необходимы знания о генетическом разнообразии и структуре популяций, произрастающих на участках активных рубок, полученные путем выявления полиморфных фрагментов ДНК. В связи с этим изучение молекулярно-генетического разнообразия и генетической структуры популяций P. sylvestris Урала с использованием ISSR-метода перспективно для разработки и оптимизации протоколов оценки состояния генофондов популяций P. sylvestris Урала. Таким образом, настоящая работа направлена на детальное изучение генетического разнообразия, генетической структуры и дифференциации природных популяций P. sylvestris в условиях их естественного произрастания в пределах Урала.

Материал и методика

В качестве объектов исследования были избраны 9 популяций сосны обыкновенной ( Pinus sylvestris L., Pinaceae). На Северном Урале и в Предуралье исследованы 4 популяции P. sylvestris, расположенные в Пермском крае: в Чердынском р-не ( PS_Ch ), в Гайнском р-не ( PS_Gn ), в Кочёвском р-не ( PS_Kh ), в Усольском р-не ( PS_Rm ). На Среднем Урале находятся 3 изученные популяции: в Кудымкарском р-не

( PS_Ln ) и в Кишертском р-не ( PS_Pr ), Пермского края, а также в Каслинском р-не Челябинской обл. ( PS_Ar ). На Южном Урале находятся 2 популяции: в Мечетлинском ( PS_Mh ) и в Салаватском р-нах ( PS_Sl ) Республики Башкортостан. Сбор растительного материала проводили с деревьев, расположенных на расстоянии не менее 50–150 м друг от друга. Географические расстояния между популяциями варьировали от минимальных 87 км между PS_Kh и PS_Gn до максимальных 628 км между популяциями PS_Gn и PS_Sl (рис. 1). Высота над уровнем моря варьировала от 117 ( PS_Rm ) до 338 м ( PS_Ar ).

Рис. 1. Карта-схема расположения изученных популяций P. sylvestris :

PS_Ch – Чердынский р-н, PS_Gn – Гайнский р-н, PS_Kh – Кочёвский р-н, PS_Rm – Усольский р-н, PS_Ln – Кудымкарский р-н, PS_Pr – Кишертский р-н, PS_Ar – Каслинский р-н, PS_Mh – Мечетлинский р-н, PS_Sl – Салаватский р-н

[Schemаtic map of the location of the studied populations of P. sylvestris :

PS_Ch – Cherdynskyi district, PS_Gn – Gainskyi district, PS_Kh – Kochevskyi district, PS_Rm – Usolskyi district, PS_Ln – Kudymkarskyi district, PS_Pr – Kishertskyi district, PS_Ar – Kislinskyi district, PS_Mh – Mechetlinskyi district, PS_Sl – Salavatskyi district]

Образцы тканей растений для исследования были собраны индивидуально с 31 дерева в каждой из изучаемых популяций. Выделение ДНК проводили CTAB-методом [Rogers, Bendich, 1985]. Масса каждого образца сухого растительного материала составляла 20 мг. Для определения концентрации и качества ДНК использовали спектрофотометр NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) пробы ДНК в каждом образце разбавляли до концентрации 10 нг/мкл.

Для оценки генетического разнообразия и генетической структуры популяций использовался ISSR-метод анализа полиморфизма ДНК. ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей 25 нг матричной ДНК, 1 × ПЦР-буфер с 2.5 мМ MgCl², 1 мкМ ISSR праймера, по 0.25 мМ каждого dNTP и 2 ед. ДНК-полимеразы Taq («Силекс М», Россия). Амплификацию проводили в термоциклере SimpliAmp™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) при следующих условиях: начальная стадия денатурации при 94 °C в течение 2 минут, за которой следовали 32 цикла при 94 °C в течение 20 с, при 52–64 °С (в зависимости от последовательности праймера) в течение 30 с и при 72 °С в течение 60 секунд с последующей финальной элонгацией при 72 °С в течение 3 минут.

Продукты ПЦР разделяли электрофорезом при 120 В в течение 3 часов в 1.7% агарозном геле с буфером 1xTBE, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете с использованием системы документации геля Gel Doc XR+ (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 п.н. + 1.5 + 3 Кб DNA Ladder, ООО. СибЭнзим-М, Москва, Россия) и программу Quantity One 1-D Analysis (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Всего проанализирован полиморфизм 141 фрагмента ДНК с 5 праймерами у

278 отдельных деревьев P. sylvestris . Для проверки достоверности полученных результатов ПЦР проводили не менее трех раз.

Для количественной оценки генетического полиморфизма и определения генетической структуры девяти изученных популяций данные были представлены в виде матрицы бинарных данных, в которой учитывалось наличие или отсутствие в спектрах фрагментов одинакового размера как состояние 1 или 0 соответственно. Компьютерную обработку данных проводили с использованием специализированного макроса GenAlEx для MS Excel для определения абсолютного числа аллелей ( n a ), эффективного ( n e ) числа аллелей [Peakall, Smouse, 2006], ожидаемой ( H E ) гетерозиготности, информационного индекса Шеннона ( I ), доли полиморфных локусов ( P 95 ) и числа уникальных аллелей ( Un ). Для описания генетической структуры популяций [Nei, 1975]. использовали следующие параметры, рассчитанные в программе POPGENE 1.31 [Yeh et al., 1996]: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов во всей популяции как мера общего генетического разнообразия ( H T ); ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции как мера внутрипопуляционного разнообразия ( H S ); доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или коэффициент генетической дифференциации ( G ST ); и AMOVA (Analysis of Molecular Variance) с расчетом индекса PhiPT (индекс подразделённости популяции) [Nei, Li, 1979]. Для определения корреляции между парными генетическими расстояниями (PhiPT) и географическими расстояниями в общей группе населения использовался тест Мантела.

На основе бинарной матрицы данных была рассчитана матрица генетических расстояний, на основе которой с помощью программы MEGA X была сгенерирована дендрограмма, отражающая степень сходства между изучаемыми популяциями [Kumar et al., 2018]. Кроме того, для проверки полученных данных был проведен анализ главных координат (PCoA), реализованный в программе PAST 4.10 [Hammer, Harper, Paul, 2001].

Результаты и их обсуждение

Молекулярно-генетический анализ девяти популяций P. sylvestris выявил 141 ПЦР-фрагмент, из них 125 были полиморфны. Используемые праймеры амплифицировали от 21 до 38 ПЦР-фрагментов, максимальное число фрагментов амплифицировалось с использованием праймера CR-212 [(CA) 6 GT]. В среднем один праймер идентифицировал 28 ПЦР-фрагментов. Длина ПЦР-фрагментов варьировала от 180 до 1500 пар оснований. Наибольшее генетическое разнообразие наблюдается в популяциях PS_Pr ( P 95 = 0.869; I = 0.289; H E = 0.184; n e = 1.294) из Кишертского р-на и PS_Ch ( P 95 = 0.911; I = 0.287; H E = 0.181; n e = 1.286) из Чердынского р-на. Наименьшее генетическое разнообразие отмечено в популяциях PS_Sl ( P 95 = 0.746; I = 0.142; H E = 0.091; n e = 1.153) из Салаватского р-на, PS_Mh ( P 95 = 0.702; I = 0.117; H E = 0.071; n e = 1.106) из Мечетлинского р-на Республики Башкортостан (табл. 1).

Таблица 1

Генетическое разнообразие изученных девяти популяций P. sylvestris

[Genetic diversity of the nine P. sylvestris populations studied]

Популяции	P 95	H E	n a	n e	I	Un
PS_Kh	0.865	0.167 (0.014)	1.716 (0.452)	1.256 (0.290)	0.271 (0.020)	0
PS_Gn	0.820	0.153 (0.014)	1.681 (0.469)	1.235 (0.292)	0.247 (0.020)	0
PS_Pr	0.869	0.184 (0.015)	1.695 (0.462)	1.294 (0.323)	0.289 (0.021)	0
PS_Ln	0.780	0.152 (0.014)	1.667 (0.473)	1.233 (0.289)	0.246 (0.020)	0
PS_Ch	0.911	0.181 (0.015)	1.695 (0.462)	1.286 (0.312)	0.287 (0.021)	0
PS_Rm	0.784	0.160 (0.014)	1.660 (0.475)	1.249 (0.300)	0.256 (0.020)	0
PS_Sl	0.746	0.091 (0.014)	1.376 (0.486)	1.153 (0.302)	0.142 (0.020)	1
PS_Mh	0.702	0.071 (0.011)	1.362 (0.482)	1.106 (0.217)	0.117 (0.017)	2
PS_Ar	0.754	0.108 (0.015)	1.312 (0.465)	1.183 (0.318)	0.162 (0.022)	5
На общую выборку	0.886	0.141 (0.005)	2.000	1.301 (0.260)	0.224 (0.007)	8

Примечания: H E – ожидаемая гетерозиготность; n a – абсолютное число аллелей на локус; n e – эффективное число аллелей на локус; I – информационный индекс Шеннона; Un – число уникальных аллелей; у всех вышеуказанных параметров в скобках даны стандартные отклонения.

Общими для всех изученных популяций P. sylvestris из 141 установленных фрагментов ДНК являются 133 (94.33%). Только 8 фрагментов ДНК (5.67%) были уникальными ( Un ), т.е. встречающиеся только в одной популяции. Уникальные аллели были обнаружены в популяциях из Салаватского, Мечетлинского и Каслинского р-нов, 1, 2 и 5 аллелей соответственно (табл. 1).

При исследовании четырех популяций сосны обыкновенной на Южном Урале было выявлено 96 фрагментов ДНК, из них 79 были полиморфны [Khanova et al., 2020]. Это число фрагментов ДНК меньше, чем в изученных нами популяциях на Урале. Это может быть обусловлено тем, что изучено меньшее число выборок на Южном Урале. Тем не менее, по таким параметрам как ожидаемая гетерозиготность ( H E = 0.239) и эффективное число аллелей ( n e = 1.385) популяции Южного Урала более генетически разнообразны [Khanova et al., 2020].

В целом изученные популяции характеризуются средними показателями генетического разнообразия ( P 95 = 0.886; I = 0.224; H E = 0.141; n e = 1.301). Данный уровень генетического разнообразия ниже, чем у популяций Южного Урала ( H E = 0.239), Оренбургского Зауралья ( H E = 0.161) и некоторых популяций Восточно-Европейской равнины ( H E = 0.170) [Рябухина и др., 2019; Khanova et al., 2020; Сбоева, 2023]. Подобные различия могут быть связаны со степенью антропогенной нагрузки, в особенности интенсивностью лесозаготовок.

Анализ генетической структуры изученных популяций P. sylvestris показал, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов ( H T ) в общей выборке составила 0.205, тогда как ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции ( H S ) меньше и составила 0.141. Коэффициент подразделения популяции ( G ST ) показывает, что на межпопуляционную составляющую приходится 0.315 от общего генетического разнообразия (табл. 2). Значения парных генетических расстояний PhiPT, обнаруженных пакетом AMOVA, находились в диапазоне от 0.080 ( PS_Kh/PS_Pr ) до 0.570 ( PS_Sl/PS_Ar ). Для всей выборки P. sylvestris индекс PhiPT составил 0.371, что близко к G ST = 0.315. Анализ молекулярной изменчивости (AMOVA) показал, что на межпопуляционную компоненту приходится 37% всего разнообразия, а на внутрипопуляционную – 63%. Данный уровень дифференциации ниже, чем у популяций Восточно-Европейской равнины [Видякин и др., 2015]. Это может быть обусловлено разницей расселения популяций в постледниковый период из разных рефугиумов [Санников, Петрова, 2012]. При этом полученные данные согласуются с предыдущими исследованиями в регионе [Vasilyeva et al., 2021; Chertov et al., 2022; Sboeva et al., 2022].

Таблица 2

Генетическая структура и дифференциация девяти популяций P. sylvestris [Genetic structure and differentiation of the nine populations of P. sylvestris ]

ISSR-праймер	Нуклеотидная последовательность (5'→ 3')	H T	H S	G ST
CR-212	CTCTCTCTCTCTCTCTTG	0.167 (0.012)	0.122 (0.004)	0.268
CR-215	CACACACACACAGT	0.266 (0.022)	0.161 (0.008)	0.392
ISSR-1	ACACACACACACACACT	0.157 (0.023)	0.098 (0.010)	0.377
M27	GAGAGAGAGAGAGAGAC	0.226 (0.027)	0.145 (0.012)	0.360
X10	AGCAGCAGCAGCAGCAGCC	0.229 (0.008)	0.178 (0.007)	0.221
На общую выборку		0.205 (0.018)	0.141 (0.008)	0.315

Примечания: H T – ожидаемая доля гетерозиготных генотипов как мера общего генного разнообразия во всей популяции; H S – ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции как мера ее внутрипопуляционного разнообразия или среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам; G ST – доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения.

На основе матрицы парных генетических расстояний (PhiPT) был проведен кластерный анализ методом Neighbor-joining и построена дендрограмма, отражающая степень сходства ISSR-профилей изученных популяций P. sylvestris (рис. 2). На дендрограмме изученные популяции были разделены на четыре кластера. Популяция Каслинского р-на выделилась в отдельную группу, что может быть связано с особенностями её расположения – на Аракульском Шихане, самом южном и высоком скальном массиве Среднего Урала.

Разделение популяций на четыре кластера подтверждается результатами анализа главных координат (PCoA), основанного на индексе PhiPT, рассчитанном с помощью пакета AMOVA (рис. 3).

Рис. 2. Дендрограмма генетического сходства изученных популяций P. sylvestris , построенная на основе полиморфизма ISSR-фрагментов методом Neighbor-joining:

I, II, III, IV – номера кластеров; цифрами над ветвями указаны генетические расстояния

[Dendrogram of genetic similarity of studied populations of P. sylvestris , built on the basis of polymorphism of ISSR profiles by Neighbor-joining method:

I, II, III, IV – cluster numbers; the numbers above the branches indicate genetic distances]

Рис. 3. Ординация изученных популяций P. sylvestris с использованием PCoA, полученного на основе матрицы генетических расстояний PhiPT:

точка – PS_Kh , плюс – PS_Gn , квадрат – PS_Pr , закрашенный квадрат – PS_Ln , крест – PS_Ch , круг – PS_Rm , ромб – PS_Sl , звёзда – PS_Mh , треугольник – PS_Ar ; I, II, III, IV – номера кластеров

[Ordination of the studied populations of P. sylvestris using PCoA, obtained on the basis of PhiPT matrix of genetic distances:

dot – PS_Kh , plus – PS_Gn , square – PS_Pr , fill square – PS_Ln , cross – PS_Ch , circle – PS_Rm , rhombus – PS_Sl , star – PS_Mh , triangle – PS_Ar; I, II, III, IV – cluster numbers]

При изучении популяций P. sylvesrtis их пространственная и генетическая структуры проверялась на соответствие модели «изоляция на расстоянии» с помощью корреляционного теста Мантела. Таким образом, попарное сравнение всех исследованных популяций выявило наличие средней положительной корреляции (R² = 0,358) между географическим и генетическим расстоянием (PhiPT), что позволяет предположить, что существенная часть различий между популяциями обусловлена расстоянием между ними.

В целом изученные популяции дифференцируются согласно их географическому расположению, но в то же время их дифференциация обусловлена и другими факторами. Одним из таких факторов может быть история расселения популяций P. sylvestris. Согласно исследованию С.Н. Санникова с коллегами, уральские популяции заселялись преимущественно из Южноуральского рефугиума, но кроме того, заселение происходило из Балканского рефугиума и рефугиумов второго порядка в Южной Сибири [Санников и др., 2014; Санников и др., 2020]. Другим фактором может быть сложный рельеф региона исследо- вания. Так, южные популяции (PS_Ar, PS_Mh, PS_Sl), обособившиеся в отдельные кластеры произрастают на высотах 338, 291 и 302 м над ур. м. соответственно, тогда как остальные изученные популяции произрастают на высотах ниже 200 м над ур. м.

Результаты данного исследования генетической структуры и дифференциации природных популяций сосны обыкновенной на Урале позволяют рекомендовать для сохранения генетического разнообразия вида в регионе исследований по одной популяции из каждого кластера: из I – популяцию из Кишерского р-на (PS_Pr), из II – популяцию из Чердынского р-на (PS_Ch) Пермского края, из III – популяцию из Са-лаватского р-на (PS_Sl) Республики Башкортостан и из IV – популяцию из Каслинского р-на Челябинской обл.

Заключение

Изученные 9 популяций Pinus sylvestris L., расположенные на Урале, характеризуются средним уровнем генетического разнообразия ( P 95 = 0.886; I = 0.224; H E = 0.141; n e = 1.301), но в популяциях Южного Урала отмечено существенное его снижение у популяций из Мечетлинского ( PS_Mh ) и Салаватского р-нов ( PS_Sl ) Республики Башкортостан, ожидаемая гетерозиготность ( H E ) 0.091 и 0.071 соответственно.

Установлено, что изученные популяции P. sylvestris дифференцированы в средней степени ( G ST = 0.315; PhiPT = 0.371), но менее, чем популяции Восточно-Европейской равнины ( G ST = 0.488; PhiPT = 0.371). Популяции сосны обыкновенной в регионе исследования образуют четыре кластера, в целом соответствующих их географическому расположению и отражающих их расселение из Южноуральского рефугиума. Корреляционный тест Мантела позволил установить положительную корреляцию между генетическими и географическими расстояниями, что дает возможность предположить, что существенная часть различий между популяциями обусловлена расстоянием между ними, но также не стоит исключать влияния рельефа местности, истории расселения популяций и интенсивности лесозаготовок. Знания о генетической дифференциации сосны обыкновенной позволят отобрать популяции для изучения БАВ и дальнейшей молекулярно-генетической идентификации популяций сосны обыкновенной. На основании полученных данных отобраны по одной популяции из каждого установленного кластера для сохранения генетических ресурсов сосны обыкновенной на Урале.