Анализ геномных ассоциаций с длиной плюсны у кур пород царскосельская, узбекская бойцовая и корниш

В птицеводстве, как и в других отраслях животноводства, морфологические характеристики скелета определяют как здоровье животных, так и уровень продуктивности [Li et al., 2021]. По некоторым данным дефекты задних конечностей являются основной причиной выбраковки животных из стад [Li et al., 2021]. Кроме того, на основании физиологического состояния задних конечностей можно судить о качестве всех костей скелета [González-Cerón et al., 2015]. Одним из самых распространенных показателей развития костей является длина плюсны, во многом благодаря высокой корреляции с живой массой [Tsudzuki et al., 2007; Gao et al., 2010]. Вероятно, это связано с тем, что длина плюсны косвенно позволяет судить о пропорциях скелета; соответственно, более длинные кости создают большую площадь прикрепления для мышц.

Царскосельская порода кур является аутосексной породой комбинированного направления продуктивности с декоративным окрасом и средней длиной конечностей, выведенной на базе ВНИИГРЖ [Вахрамеев и др., 2024]. При выведении преследовалась цель создания оптимального сочетания мясных и яичных качеств, что было достигнуто скрещиванием 4-линейных гибридов пород корниш × белый плимутрок с курами пород нью-гемпшир и полтавская глинистая [Азовцева и др., 2024]. Все породы, за исключением корниш, относятся к мясо-яичному направлению продуктивности. Характерной чертой корниш, породы мясного направления продуктивности, является короткая плюсна, которая обеспечивает лучшую жизнеспособность тяжелым бройлерам [Emrani et al., 2020; Magnuson et al., 2020]. Интересно, что родоначальником породы корниш являются английские бойцовые куры – особи с высокими сильными ногами, которые участвовали в становлении многих других бойцовских пород, кроме узбекской бойцовой, которая относится к породам народной селекции и также характеризуется длинными костями конечностей [Силюкова, 2018].

Целью данного исследования было выявление кандидатных регионов генома и Single Nucleotide Polymorphism (SNP), ассоциированных с длиной плюсны, у пород корниш, узбекская бойцовая и царскосельская, на основании результатов полногеномного поиска ассоциаций (GWAS, genome-wide association study) с показателем длины плюсны у породы царскосельская.

Материалы и методы

Материалами для исследования стали птицы пород царскосельская (n = 96), узбекская бойцовая (n = 22) и корниш (n = 22), содержащиеся в ЦКП «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» (ВНИИГРЖ, г. Пушкин). Для породы царскосельская в возрасте 42 недель были получены значения длины плюсны. Для проведения анализа от всех пород были отобраны образцы крови из вен конечностей, из которых была выделена ДНК по стандартной фенольной методике. Полученная ДНК была проанализирована на спектрофотометре NanoDrop2000c (Thermofisher Scientific Inc., США) для определения чистоты образцов и их концентраций. Полногеномное генотипирование осуществлено с использованием биочипа Illumina Chicken 60K SNP iSelectBeadChip (Illumina Inc., США), плотность покрытия 57,636 однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Контроль качества образцов произведен в программе Genome Studio (Illumina Inc., США). Образцы с качеством генотипирования более 95% допущены в анализ. Все выделенные образцы (n = 140) успешно прошли контроль качества. Редактирование и фильтрация данных чипов проведены при помощи PLINK 1.9 с частотой минорных аллелей (MAF) > 0.05, в результате чего количество SNP в анализе сократилось до 43,123. GWAS-анализ осуществлен при помощи про- граммного обеспечения (ПО) EMMAX, где была сгенерирована матрица родства «identity-by-state» (IBS). Модель расчета влияния SNP на признак

Y = Xb + u + e , где Y – вектор фенотипов, b – эффект SNP, X – расчётная матрица генотипов SNP, u – вектор аддитивных генетических эффектов, который считается нормально распределенным со средним значением, равным 0, и (ко)дисперсией σ2aG , где σ2a — аддитивная генетическая дисперсия, а G — матрица геномных отношений; e — вектор случайных остаточных эффектов.

При помощи поправки Бонферрони для SNP установлены достоверно значимый 1,16E-06 (0.05/43,123) и предположительно значимый 2,31E-05 (1.00/43,123) уровни. Общегеномная значимость оценена методом simple в R, а расчет эффективного числа независимых тестов – в программе Meff. Аннотирование SNP проведено в геномном браузере ENSEMBL на основании сборки генома GRCg6a красной джунглевой курицы (Red Jungle Fowl). При помощи базы данных NCBI изучены функциональные характеристики всех генов, расположенных в пределах 0,5 Мб от выявленных SNP. На основании генов, задействованных в остеогенезе или костном гомеостазе, определены границы кандидатных регионов, контролирующих длину плюсны. Затем в пределах границ выявленных кандидатных регионов проведен поиск всех SNP, наблюдаемых у пород царскосельская, корниш и узбекская бойцовая. Для сокращения количества анализируемых полиморфизмов, при помощи ПО Eigensoft была применена дополнительная сортировка SNP, максимально различающих породы друг от друга. Также, для оставшихся после сортировки SNP дополнительно приведены частоты встречаемости аллелей по породам.

Результаты и обсуждение

В результате проведения GWAS-анализа для царскосельской породы выявлено 2 предположительно значимых SNP и, соответственно, 2 кандидатных региона, ассоциированных с показателем длина плюсны (таблица).

Предположительно значимые SNP и кандидатные регионы, ассоциированные с длиной плюсны у царскосельской породы кур

[Suggestive SNPs and candidate regions associated with tarsus length in Tsarskoye Selo breed]

SNP	Хромосома: Позиция	P-value	Замена	Локализация	Ген-кандидат	Кандидатный регион
rs16204837	26:5,071,683	4,01E-06	T/C	интрон	TAF8	5,068,707–5,174,489
				Рядом:	BTG2
					FMOD
					PREPL
rs315156385	9:16,574,949	1,36E-05	T/G	интрон	DCUN1D1	16,298,653–16,586,728
				Рядом:	FETUB

Особенность GWAS-исследований заключается в идентификации геномных ассоциаций с фенотипическими признаками, в данном случае – с признаком длины плюсны. Это свидетельствует о том, что у исследуемого массива особей отмечена высокая вероятность влияния настоящих регионов на развитие костей плюсны. Для подтверждения этой гипотезы гены в выявленных регионах подвергаются функциональной аннотации, причем поиск проводится среди всех видов млекопитающих, т.к. зачастую гены обладают большим числом паралогов, разошедшихся в результате видообразования. Наличие связи выявленных генов с процессами костеобразования в других исследованиях еще не является расшифровкой точного механизма их действия на формирование длины плюсны у кур. Тем не менее, само наличие данных о влиянии этих генов на остеогенез в других видах свидетельствует о достоверности обнаруженных ассоциаций.

SNP rs16204837 (4,01E-06) на 26 хромосоме расположен в гене TAF8 (TATA-box binding protein associated factor 8), кодирующем один или несколько факторов, связанных с TATA-связывающим белком. Ген TAF8 задействован в процессах транскрипции и ее регуляции. Кроме того, он принадлежит к группе белков развития – важной группы генов, от которых зависит корректное течение эмбрионального развития организма. Подтверждением этой роли являются исследования мутаций TAF8 , которые приводят к нейродегенеративным заболеваниям, сопровождающимся задержкой роста, церебральной атрофией и микроцефалией [Wong et al., 2022]. Для определения потенциальных границ кандидатных регионов, ассоциированных с длиной плюсны, вблизи целевого SNP были изучены участки длиной в 1 Мб. Такая тактика позволила выявить на 9 хромосоме ряд генов, ассоциированных с процессами остеогенеза. Так, в пределах 0,5 Мб идентифицированы гены BTG2, FMOD и PREPL . Ген BTG2 (BTG anti-proliferation factor 2) задействован в процессах транскрипции и ее регуляции, а также является членом семейства генов с антипролиферативными свойствами BTG/Tob. В исследовании на мышах ген BTG2 усиливал транскрипционную активность передачи сигналов костного морфогенетического белка (BMP, Bone morphogenetic protein), а динамические паттерны его экспрессии в развивающихся сомитах указывают на его участие в формировании паттерна позвонков [Park et al., 2004]. Ген FMOD

(Fibromodulin), кодирующий фибромодулин, влияет на скорость образования фибрилл и, предположительно, играет основную роль в фибриллогенезе коллагена. Участие FMOD в эмбриональных процессах костеобразования подтверждается его экспрессией хондроцитами и остеобластами во время эндохондрального и внутри-мембранозного окостенения [Tevlin et al., 2023]. Способность FMOD облегчать сшивание коллагена свидетельствует о его важности для формирования и прочности костей [Hudson et al., 2017]. Последний ген группы, PREPL (Prolyl endopeptidase like) , представляет собой матричный белок, экспрессируемый в базальных мембранах, хряще и костном матриксе. PREPL обладает сильным антирезорбтивным действием, ингибируя образование остеокластов, благодаря чему был предложен в качестве нового агента при лечении костных патологий, вызванных повышенной активностью остеокластов [Rucci et al., 2013].

SNP rs315156385 (1,36E-05) на 9 хромосоме расположен в интроне DCUN1D1 (Defective in cullin ned-dylation 1 domain containing 1), обеспечивающего активность белков семейства куллинов. Являясь частью убиквитинлигазного комплекса, DCUN1D1 играет важную роль в процессах убиквитинирования и неддилирования, которые регулируют стабильность и функцию целевых белков [Paccez et al., 2024]. Для второго SNP также были рассмотрены близлежащие гены. Так, в пределах 0,3 Мб от целевого SNP обнаружен ген FETUB (Fetuin B) – член семейства фетуинов, который играет важную роль в процессе оплодотворения. Фетуины задействованы в широком спектре процессов, в числе которых реакция на системные воспаления, регуляция рецепторов инсулина и фактора роста гепатоцитов, а также участие в процессах остеогенеза и костной резорбции. Так, снижение концентраций фетуина в крови характерно для заболевания Педжета, а повышение – для заболеваний несовершенного остеогенеза [Kubota et al., 2012].

Имеющиеся данные позволяют сделать вывод, что ассоциации с длиной плюсны на 9 и 26 хромосомах в царскосельской породе подтверждаются явным влиянием генов, обнаруженных вблизи SNP, на процессы остеогенеза. На основании этого можно предположить, что идентифицированные регионы могут оказывать влияние на длину плюсны и в других породах. Для проверки этой гипотезы в представленных регионах был проведен поиск всех SNP для пород царскосельская, корниш и узбекская бойцовая. Всего идентифицировано 6600 SNP: 5162 SNP локализованы на 9 хромосоме, а оставшиеся 1438 – на 26. При помощи программы Eigensoft отсортированы 50 SNP на 9 хромосоме, максимально отличающие породы друг от друга. Из них 33 SNP локализованы в гене MCF2L2 , 10 SNP – в гене RFC4 , 3 SNP – в гене MCCC1 , 2 SNP – в EIF4A2 , а также по 1 SNP в генах LAMP3 и DCUN1D1 . Для упрощения визуализации SNP были дополнительно отфильтрованы – оставлены только те SNP, частоты аллелей которых максимально различаются от породы к породе. В результате для визуализации были использованы 16 SNP гена MCF2L2 , 2 SNP – RFC4 , 3 SNP – MCCC1 , 2 SNP – EIF4A2 , и 1 SNP гена LAMP3 . Для 26 хромосомы не было выявлено SNP, значительно отличающих породы друг от друга.

Наибольшее число SNP получено в гене MCF2L2 (MCF.2 cell line derived transforming sequence-like 2), кодирующего фактор обмена гуаниновых нуклеотидов семейства Rho (рис. 1).

Ген MCF2L2 SNP «316787598	Ген MCF2L2 SNP rs313450934	Ген MCF2L2 SNP rs315728342	Ген MCF2L2 SNP rsl5977669
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1	0 0,2 0,4 0,6 0,8 1	0 0,2 0,4 0,6 0,8 1	0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
■ A BG	■ A BG	■ A BG	■ Т пС
Ген MCF2L2 SNP «316790685	Ген MCF2L2 SNP rs734557881	Ген MCF2L2 SNP «315403266	Ген MCF2L2 SNP rsl5977720
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1	0 0,2 0,4 0,6 0,8 1	0 0,2 0,4 0,6 0,8 1	0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
■ A BA	■ T c	■ A BG	ВТ ас
Ген MCF2L2 SNP «732226617	Ген MCF2L2 SNP 9:16471061	Ген MCF2L2 SNP «318000386	Ген MCF2L2 SNP «315825687
		узбекская бойцовая С^^^^^^^^^^^^ .	узбекская бойцовая ИЗ                   _
		корниш ^^^=^^Z     .	корниш ^^ZZ^         _
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 ■ A BG	0 0,2 0,4 0,6 0,8 1	царскосельская ^^^^^^^^^^^^М 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 BA BG	царскосельская ^^^^^=^^^^ 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 ■ Т пС
Ген MCF2L2 SNP rsl5977665	Ген MCF2L2 SNP 9:16471061	Ген MCF2L2 SNP «14676797	Ген MCF2L2 SNP rs315716924
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1	0 0,2 0,4 0,6 0,8 1	0 0,2 0,4 0,6 0,8 1	0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
■ T «G	■ A BG	ВТ ПС	BA BG

Рис. 1. Частоты аллелей для SNP в гене MCF2L2 , наблюдаемые в породах царскосельская, корниш и узбекская бойцовая

[Allele frequencies for SNPs in the MCF2L2 gene in Tsarskoye Selo, Cornish and Uzbek Game chicken breeds]

Известно, что домен фактора обмена Rho-гуаниновых нуклеотидов обскурина может активировать сигнальный путь ГТФазы RhoA, которая играет ключевую роль в развитии и поддержании скелетных мышц [Ran et al., 2020]. Кроме того, ранее MCF2L2 был предложен в качестве кандидатного гена, ассоциированного с неанеуплоидными структурными аномалиями эмбрионов [Carss et al., 2014]. С точки зрения развития костей важность гена MCF2L2 обусловлена его участием в комплексе ULK1 при индукции аутофагии. Так, в исследованиях выявлено, что нокаут MCF2L2 приводит к ингибированию аутофагии [Cao, 2012]. Последняя представляет особое значение для развития и нормального функционирования костной ткани, т.к. она влияет на выживание и функции всех типов клеток костей – остеобластов, остеокластов и остеоцитов, а также хряща – хондроцитов [Shapiro et al., 2013]. Исходя из вышесказанного можно сделать вывод, что аутофагия – важный процесс для поддержания гомеостаза костей.

Для гена RFC4 (Replication factor C subunit 4) обнаружено 10 SNP, однако максимально различимы породы, согласно частотам аллелей, только по 2 SNP (рис. 2). RFC4 кодирует белковый комплекс, проявляющий ДНК-зависимую АТФазную активность. Биаллельные варианты RFC4 ассоциированы с недиагности-рованным расстройством человека, характеризующимся нарушением координации, мышечной слабостью и снижением массы тела [Morimoto et al., 2024]. В исследованиях остеосаркомы гены семейства RFC , включая RFC4, проявили как повышенную экспрессию, так и участие в репликации ДНК, благодаря чему высказано предположение о их важности при развитии данного заболевания [Peng et al., 2017].

Ген ЕИ4А2, SNP rsl6673425

узбекская бойцовая tZ^^^^^^^^^H корниш царскосельская I^^=^^Z

Ген EIF4A2, SNP rsl6673425

Ген МССС1, SNP rsl4676820

Ген LAMP3, SNP rs736777567

узбекская бойцовая корниш царскосельская

узбекская бойцовая корниш царскосельская

узбекская бойцовая корниш царскосельская

о

о

о

IT ИС

IT 1G

IT ИС

Ген RFC4, SNP rsl3608982

узбекская бойцовая ^^^^^^^^^Н^^ корниш царскосельская ^^^^^^^^^ш   :

О 0,2 0,4 0,6 0,8 1

• ■    A 1G

Ген RFC4, SNP rs!3608981 Ген МССС1, SNP rs315700891

узбекская бойцовая ^^^^^^^^^^ корниш [=11

царскосельская ^^^^М^^^^^^НН

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

узбекская бойцовая корниш царскосельская

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Ген МССС1, SNP rs312783666

узбекская бойцовая '■^Ш^Ш^Ш^шЫ корниш ^^^^^^Н^^^^^Ы царскосельская ^^■^■■^■^ММВ

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

• ■    А ■ G

Рис. 2. Частоты аллелей для SNP в генах MCCC1, LAMP3, RFC4 и EIF4A2 , наблюдаемые в породах царскосельская, корниш и узбекская бойцовая

[Allele frequencies for SNPs in EIF4A2 , RFC4 , LAMP3 , and MCCC1 genes observed in Tsarskoye Selo, Cornish and Uzbek Game chicken breeds]

В гене MCCC1 (Methylcrotonyl-CoA carboxylase subunit 1), кодирующем субъединицу 1 фермента ме-тилкротонил-КоА-карбоксилазы, обнаружено 3 SNP (рис. 2). Мутации MCCC1 приводят к нарушению метаболизма лейцина. В исследовании взаимосвязи сигнального пути mTOR и аутофагии выявлено, что ингибирование этого гена подавляет активность комплекса mTORC1, что, в свою очередь, приводит к активации аутофагии [Nicklin et al., 2009]. В многочисленных исследованиях на мышах выявлено, что мутации в генах, связанных с аутофагией, проявляются пониженным формированием и минерализацией костей, низкой костной массой, а также спонтанными переломами [Suzuki, Iwata, 2021], из чего следует, что активность MCCC1 опосредованно оказывает негативное влияние на остеогенез и костный гомеостаз.

Для EIF4A2 (Eukaryotic translation initiation factor 4A2) выявлено 2 SNP (рис. 2). EIF4A2 кодирует РНК-геликазу, необходимую для связывания мРНК с рибосомой, а также задействованную в биосинтезе белка. Известно, что он участвует в развитии мышц у целого ряда млекопитающих, включая человека, крупного рогатого скота и свиней. Характер экспрессии EIF4A2 у свиней во время эмбрионального и постэмбрионального развития мышц указывает на его значительную роль в миогенезе [Zhang et al., 2022].

Для гена LAMP3 (Lysosomal associated membrane protein 3), как и для DCUN1D1 (Defective in cullin neddylation 1 domain containing 1), обнаружен 1 SNP (рис. 2). LAMP3 кодирует гликопротеин лизосомальной мембраны, который играет роль в процессе слияния лизосомы с аутофагосомой, модулируя тем самым процесс аутофагии [Nagelkerke et al., 2014]. Установлено, что LAMP3 сильно активируется при метастатической остеосаркоме [Li et al., 2017]. Нокаут LAMP3 существенно подавляет жизнеспособность клеток остеосаркомы и способствует апоптозу, тогда как его сверхэкспрессия, наоборот, повышает жизнеспособность и отменяет апоптоз [Liu et al., 2018]. В исследовании на собаках вышеупомянутый ген

DCUN1D1 также характеризовался повышенной экспрессией в тканях, пораженных остеосаркомой [Rodrigues et al., 2016].

Так, практически для всех изученных генов обнаружены ассоциативные связи с остеогенезом и гомеостазом костей. Приняты во внимание как связи с аутофагией, так и с неконтролируемым разрастанием костной ткани – остеосаркомой. Это позволяет предположить, что регион на 9 хромосоме формирует гап-логруппу, способную оказывать влияние на развитие кости плюсны.

Важно отметить, что изучаемые породы проявляют разные значения длины плюсны: так, порода корниш характеризуется короткой плюсной, узбекская – длинной, а царскосельская порода занимает промежуточное положение с уклоном в сторону длинной плюсны, как у узбекской бойцовой. В связи с этим необходимо учитывать те гены, в которых отмечены наибольшие различия по частотам аллелей между исследуемыми породами. Так, SNP в генах MCCC1 , LAMP3 и MCF2L2 были максимально различны между породами корниш и узбекская бойцовая, которые противопоставляются друг другу по длине плюсны. Вероятно, распределение аллельных частот породы корниш в идентифицированных SNP оказывает влияние на формирование короткой плюсны, тогда как распределение в узбекской бойцовой приводит к развитию длинной плюсны (рис.1). Принимая во внимание фенотипическую близость царскосельской и узбекской бойцовой пород по показателю длины плюсны, стоит отметить схожесть их аллельных частот. В частности, для них наблюдается схожесть аллельного распределения в тех же генах – MCCC1 , LAMP3 и MCF2L2 . В частности, это SNP rs15977663, rs15977665, rs316790685 и rs15977720 гена MCF2L2 , rs312783666 и rs315700891 гена MCCC1 , а также SNP rs736777567 гена LAMP3 .

Резюмируя вышесказанное, выявленные сходства и различия в аллельных распределениях генов MCF2L2, LAMP3 и MCCC1 делают последних перспективными генами-кандидатами, определяющими развитие длины плюсны. Тем не менее, для изучения генетических механизмов, лежащих в основе формирования длины плюсны, рекомендуется продолжить изучение генетической структуры региона 9 на хромосоме в других породах.

Заключение

В результате исследования с показателем длины плюсны ассоциирован кандидатный регион на 9 хромосоме. В нем найдено 50 SNP в генах EIF4A2, RFC4, MCF2L2, LAMP3, MCCC1 и DCUN1D1 , максимально различающих породы между собой. Часть генов участвует в процессах формирования скелетных мышц и их гомеостаза ( EIF4A2, RFC4, MCF2L2 ), другая – в процессах костного гомеостаза и аутофагии ( MCF2L2, MCCC1, LAMP3) , а также развития и течения остеосаркомы ( LAMP3, MCCC1, DCUN1D1, RFC4 ). Максимально различные аллельные частоты между породами корниш и узбекская бойцовая наблюдаются в SNP генов MCCC1 , LAMP3 и MCF2L2 , и для SNP этих же генов отмечены максимальные сходства аллельных частот в породах царскосельская и узбекская бойцовая. Для изучения генетических механизмов, определяющих длину плюсны, рекомендуется дальнейшее изучение влияния генов и SNP кандидатного региона в других породах. Принимая во внимание, что рост и развитие костных структур находится под сложным генетическим контролем, раскрытие его молекулярных механизмов может способствовать значительному повышению эффективности селекции.