Анализ генов стрессоустойчивости у растений березы после воздействия углеродных нанотрубок

Применение нанотехнологий в сельском и лесном хозяйстве может привести к значительному

(  38  )

улучшению роста и урожайности растений, а также к сокращению использования генетически модифицированных организмов (ГМО) и агрохимикатов [2,3]. В последнее десятилетие исследования взаимодействий между растениями и наноматериалами быстро увеличились благодаря открытию положительного влияния наноматериалов на растения [4].

Однако сообщения о воздействии наночастиц на растения противоречивы. Например, такие наночастицы, как Cu 2 O (0-160 частей на миллион) и TiO 2 (0,05–0,2 г/л-1) в некоторых исследованиях усиливали рост томатов за счет увеличения всхожести, удлинения корней / побегов, транспирации и синтеза хлорофилла [5]. Напротив, было обнаружено, что наночастицы, попадая в клетки растений либо через эндоци-тоз, либо с помощью других транспортных систем и накапливаясь внутри тканей растений [6, 7], взаимодействуют с молекулами растений, что в конечном итоге приводит к искажению морфо-анатомических особенностей и многих физиологических функций растений [8]. Фитотоксичные наночастицы при взаимодействии с растениями могут вызывать мутагенные повреждения ДНК [9], генерировать активные формы кислорода, разрушать клеточные мембраны, усиливать перекисное окисление липидов мембран и, таким образом, ингибировать метаболизм и рост растений [10]. Воздействие наночастиц на растения определяется степенью поглощения наночастиц, накопления в органах растения и последующей транслокации в различные места. Эти три процесса также зависят от физико-химических особенностей наночастиц, генотипов и анатомии растений.

Потенциал применения наноматериалов в растениеводстве очень широк: от наноудобрений для улучшения роста и урожайности, пестицидов для борьбы с вредителями и болезнями растений до наносенсоров, контролирующих здоровье растений и качество почвы. Значительная часть таких исследований сконцентрирована на углеродных материалах, в частности на углеродных нанотрубках, обладающих выдающимися физико-механическими свойствами и легкостью функционализации. Результаты оценки воздействия углеродных наноматериалов противоречивы, однако авторы ряда работ подчеркивают положительные эффекты воздействия на растения растительные объекты.

В исследовании [11] авторы сообщают о негативном воздействии на капусту, помидоры и красный шпинат графеновых пластинок, использование данного материала приводит к подавлению роста и снижению биомассы растения, а также увеличении концентрации активных форм кислорода. Однако в работе [12] авторами было показано увеличение прорастания и прироста биомассы при воздействии графеновых наноматериалов на сорго. Zhang et al. [13] сообщили о применении оксида графена в качестве ускорителя всхожести семян томата, за счет облегченного захвата воды. Также существуют исследования по применению фуллеренов в качестве стимуляторов роста растений. Например, авторы [14] сообщили о положительном влиянии фуллеролов на биомассу и фитоме-дицинские компоненты при обработке горькой дыни. Однако Liu et al. в своем исследовании [15] сообщили о нарушение клеточной границы и ингибировании роста клеток табака, возможно, из-за адсорбции водорастворимых карбоксифуллеренов на клеточной стенке посредством гидростатического взаимодействия с карбоксильными группами фуллеренов.

В последнее десятилетие также идет активная работа по исследованию влияния более простых в производстве и дешевых по сравнению с ОУНТ многостенных углеродных нанотрубок (МУНТ) на растения. МУНТ способны проникать в структуру клеточных стенок облегчая при этом поглощение воды, что способствует увеличению роста, например, брокколи, нута (при использовании гидрофильных МУНТ), ячменя, сои, кукурузы. Также было установлено положительное влияние функционализированных МУНТ на рост клеток табака.

Применение нанотехнологий в лесном и сельском хозяйстве может привести к значительному улучшению роста и урожайности растений, а также к сокращению использования генетически модифицированных организмов (ГМО) и агрохимикатов. Однако несмотря на растущий объем исследований, доступная научная литература, предоставляющая подробную информацию о воздействии наночастиц на стрессо-устойчивость, разрознена и, следовательно, требует значимого и немедленного внимания, чтобы лучше систематически объяснить ингибирующие или стимулирующие воздействия наночастиц.

Целью работы является определение воздействия многостенных нанотрубок в различных концентрациях на гены стрессоустойчивости двух видов древесных растений Betula pubescens Ehrh. и B. pendula Roth.

Условия, материалы и методы

Объект исследования. Чистые многостенные углеродные нанотрубки (МУНТ) были приобретены у MST-Nano (Riga, Latvia). Додецилсульфат натрия (SDS) или натриевая соль лаурилсерной кислоты с содержанием основного компонента 99% была приобретена Sigma Aldrich («Sigma», L4509) и использовалась без дополнительной очистки. Для получения стабильных растворов МУНТ 0,5 г. SDS добавляли к 95,5 г. дистиллированной воды двойной очистки (система очистки Milly-Q) и полностью растворяли, потом добавляли необходимое количество МУНТ для нужной концентрации. Диспергирование проводили на ультразвуковом гомогенизаторе Soni-cator Q500 в течение 30 минут с мощностью 100 Вт и частотой 22 кГц. Таким образом были приготовлены растворы с концентрацией МУНТ 1, 10, 50, 100 мг/л. Для проведения эксперимента использовали проростки березы пушистой и березы повислой полученной методом клонального микроразмножения. Микрорастения высаживали в пластиковые контейнеры объемом 500 см3. В качестве субстрата использовали торфогрунт марки «Veltorf», Псковская область. Микрорастения находились в теплице с постоянно поддерживаемой температурой на уровне 27/17 °C день / ночь и относительной влажностью не менее 85%. Всего в эксперименте участвовали 300 растений (150 березы повислой, 150 березы пушистой). В качестве контрольных образцов использовали по 30 растений каждого сорта. Растения, участвующие

(  39  )

в эксперименте поливали единоразово раствором приготовленной концентрации МУНТ. Объем раствора для полива был одинаковым для всех образцов и составлял 50 мл. Для определения изменения стрессо-устойчивости экстракцию РНК проводили модифицированным CTAB-методом. Продукты выделения визуализировали в 1%-ном агарозном геле, окрашенном интеркалирующим красителем этидиум бромидом (PanReac Applichem, Испания, Германия); качество и однородность РНК оценивали с помощью системы гель-документирования Infinity VX2 1126MX X-Press (Vilber Lourmat, Франция). Праймеры к генам устойчивости подбирали из базы данных NCBI и с использованием программы Primer3 (рисунок 1).

Рис. 1 - Последовательности праймеров к генам стрессоустойчивости

Анализ экспрессии генов устойчивости проводили 2-ΔΔCt методом с использованием программного об еспечения LightCycler480 II v 1.5.1 (Roche, Швейцария). В качестве референсного использовали ген GAPDH

Результаты исследований и их обсуждение

Исследование воздействия углеродных нанотрубок в разных концентрациях на растения березы пушистой и березы повислой выявило у них изменение

экспрессии генов стрессоустойчивости, причем это изменение в значительной степени зависело от используемой концентрации. Воздействие 1 мг/л наночастиц на растения березы пушистой способствовало увеличению экспрессии генов DREB2 , PR-1 и PR-10 в 2,1, 8,1 и 3,3 раза, соответственно (рисунок 2).

a)                                                                 б)

Рис. 2 – Экспрессия генов стрессоустойчивости у растений березы пушистой (а) и повислой (б): белые столбцы – нанотрубки в концентрации 1 мг/л, серые столбцы – 10 мг/л, черные столбцы – 50 мг/л и заштрихованные столбцы – 100 мг/л

При увеличении концентрации МУНТ ответная реакция растений наблюдалась на уровне DREB2 и PR-1 , экспрессия которых увеличилась в 2,4 и 4,3 раза, соответственно. Дальнейшее увеличение концентрации МУНТ способствовало ответной реакции на уровне одного из проанализированной группы гена PR-1 , экспрессия которого увеличилась в 3,4 раза относительно контроля. У березы повислой наблюдалось значительное увеличение экспрессии генов DREB2 и PR-10 под воздействием 10 и 50 мг/л МУНТ, в то время как более высокие концентрации не вызвали изменения в экспрессии анализируемых генов.

Экспрессия генов LEA8 и PAL не была стимулирована воздействием наночастиц у разных генотипов березы, а высокие концентрации наночастиц 100 мг/л вызывали снижение экспрессии DREB2 и PAL .

Полученные результаты свидетельствуют о стимулирующем влиянии МУНТ в низких концентрациях (1-10 мг/мл) на ростовые параметры и экспрессию генов устойчивости у растений березы пушистой и повислой. Увеличение концентрации до 100 мг/л имеет ингибирующий эффект, что выражается в снижении ростовых показателей и экспрессии генов DREB2 и PAL у березы пушистой, что свидетельствует о

большей чувствительности данного генотипа к высоким концентрациям МУНТ.

Выводы. В исследовании были использованы многостенные углеродные нанотрубки, растворы готовили с применением диспергирования на ультразвуковом гомогенизаторе Sonicator Q500. Были приготовлены растворы с концентрацией МУНТ 1, 10, 50, 100 мг/л. Экспрессия генов стрессоустойчивости DREB2 и PR-10 значительно увеличилась под воздействием 1 мг/л МУНТ на растения обоих видов. Полученные результаты свидетельствуют о стимули- рующем влиянии МУНТ в низких концентрациях (110 мг/мл) на ростовые параметры и экспрессию генов устойчивости у растений березы пушистой и повислой. Увеличение концентрации до 100 мг/л имеет ингибирующий эффект, что выражается в снижении ростовых показателей и экспрессии генов DREB2 и PAL у березы пушистой, что свидетельствует о большей чувствительности данного генотипа к высоким концентрациям МУНТ.