Анализ хромосомных аберраций в клетках млекопитающих при воздействии различных видов ионизирующего излучения

Анализ частоты радиационно-индуцированных аберраций хромосом в клетках млекопитающих при их облучении in vitro различными видами ионизирующих излучений играет важную роль в задачах исследования радиобиологических свойств клеток [2], при количественной оценке качества излучения на основе относительной биологической эффективности (ОБЭ), а также для биологической дозиметрии на основе цитогенетического теста [1]. Так, метод оценки поглощённой дозы по радиационным маркерам, возникающим в ядре клетки под действием радиации, имеет целью дополнить методы физической дозиметрии, когда последние неприменимы или требуют уточнения. Обычно это касается нештатного обращения с источниками излучений, аварийных ситуаций или подтверждения факта радиационного воздействия в прошлом. Таким методом является анализ хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека, чему способствовал ряд существенных фундаментальных достижений в области радиобиологии клеток млекопитающих. В первую очередь к ним относится доказательство одинаковой радиационной чувствительности хромосом лимфоцитов человека in vitro и in vivo [9]. Кроме того, внедрению метода анализа хромосомных аберраций способствовали открытые в 60-е годы возможности получения метафазных препаратов и метод дифференциального («арлекино-вого») окрашивания хроматид, что позволило различать митотические деления, а также метод поперечного сегментного окрашивания (G-banding), что позволило идентифицировать все возможные типы аберраций хромосом, включая симметричные аберрации.

Хвостунов И . К .* – зав . лаб ., д . б . н .; Пятенко В . С . – вед . научн . сотр ., к . б . н .; Шепель Н . Н . – ст . научн . сотр ., к . б . н .; Коровчук О . Н . – научн . сотр .; Гол уб Е . В . – вед . научн . сотр ., д . б . н .; Жиронкина А . С . – научн . сотр .; Хвостунова Т . И . – научн . сотр .; Лычагин А . А . – зав . лаб ., к . ф .- м . н . ФГБУ МРНЦ Минздрава России .

В последние годы для целей биологической дозиметрии, в основном ретроспективной, широко применяется метод селективного окрашивания хромосом, основанный на их гибридизации in situ при помощи ДНК-проб, специфичных к отдельным хромосомам – FISH-метод (fluorescence in situ hybridization). На его основе также был разработан уникальный способ окрашивания хромосом в виде поперечных многоцветных полос (mBand) [6], что позволяет абсолютно точно идентифицировать любые внутрихромосомные обмены, например, пери- и парацентрические инверсии. Такого рода хромосомные аберрации, а также сложные межхромосомные обмены, являются перспективными биологическими маркерами для плотноионизирующих излучений [5]. На практике наибольшее распространение получили методы биологической дозиметрии, основанные на анализе аберраций хромосом обменного типа – дицентриков и симметричных транслокаций. При этом методической основой соотношения частоты наблюдаемых аберраций и поглощённой дозы для цели калибровки являются соответствующие зависимости, полученные in vitro [4, 7, 11]. Основой всех перечисленных выше задач являются дозовые зависимости частоты хромосомных аберраций, полученные в контролируемых лабораторных условиях на различных типах клеток млекопитающих. В настоящей работе такие исследования выполнены на лимфоцитах крови человека и двух линиях перевиваемой культуры клеток китайского хомячка.

Материалы и методы

В настоящей работе для оценки радиобиологических свойств клеток млекопитающих использовали лимфоциты периферической крови человека и клетки двух линий перевиваемой культуры клеток китайского хомячка Chinese hamster ovary (Панэко). Радиационное воздействие на клетки млекопитающих реализовывалось с помощью стандартного облучения гамма-квантами ⁶⁰Co, а также пучком нейтронов с энергией 14 МэВ [10] и пучком протонов ускорителя И-100 с энергией 73 МэВ [3].

Для гамма-облучения 60Co применялась медицинская установка «Луч» при высокой мощности дозы порядка 0,5 Гр/мин. Дозиметрическое обеспечение осуществлялось путём измерения мощности экспозиционной дозы ионизационной камерой VAK-253 с γ-дозиметром 27012, а также при помощи термолюминесцентных дозиметров-«свидетелей» ТЛД-100 (Toledo). ТЛД-дозиметры представляли собой пластиковые цилиндры высотой 5 мм и диаметром 3 мм, заполненные радиационно-чувствительным порошком на основе LiF, которые крепились на облучаемые флаконы с клетками.

Облучение клеток протонами с энергией 73 МэВ осуществлялось на ускорителе И-100 (Протвино). При облучении биологических объектов использовали два режима с мощностью дозы: ~ 0,14 Гр/импульс (0,1⋅106 Гр/с) и ~ 5 Гр/импульс (0,8⋅106 Гр/с). Для определения полученной биологическим объектом дозы использовали следующие специально разработанные, изготовленные и откалиброванные детекторы: прецизионный токовый трансформатор (ИД-10), цилиндр Фарадея и термолюминесцентные детекторы [3].

Облучение клеток нейтронами с энергией 14 МэВ производилось при помощи портативного импульсного нейтронного генератора на запаянных трубках ИНГ-03 (МРНЦ) с мощностью дозы до 0,1 Гр/мин. Физико-дозиметрические расчёты характеристик нейтронной установки на базе импульсного нейтронного генератора ИНГ-03 были получены с помощью программы MCNP-4B, и верифицированы путём экспериментального измерения потока нейтронов на различных расстояниях от коллиматора. Сборку из 5 флаконов с исследуемыми клетками размещали вплотную к коллиматору генератора. Поглощённые дозы в каждом из флаконов оценивали расчётным методом в зависимости от расстояния до коллиматора [10].

Анализ нестабильных аберраций в лимфоцитах крови человека производили стандартным методом [7]. Образцы крови четырёх доноров (2 мужчины и 2 женщины) в возрасте от 30 до 40 лет подвергались воздействию гамма-квантов 60Co в дозах от 0,035 Гр до 4,27 Гр. На каждую величину дозы нами проанализировано суммарно от 300 до 7999 метафаз. При исследовании воздействия нейтронов с энергией 14 МэВ образцы крови одного донора женского пола, 18 лет, облучали в дозах от 0,2 Гр до 2 Гр. На каждую величину дозы приходилось от 150 до 760 метафаз.

При анализе нестабильных аберраций культивировали цельную кровь (0,8 мл) во флаконах Карреля в культуральной питательной среде следующего состава: 6,16 мл среды RPMI-1640; 1,6 мл инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки; 0,08 мл L-глютамина; 0,08 мл раствора антибиотиков; 0,15 мл фитогемагглютинина. Инкубация культур клеток производилась в термостате при 37 оC в течение 48 ч. Для накопления метафаз за 2 ч до окончания инкубации во флаконы добавляли раствор демеколцина в концентрации 0,2 мкг/мл среды. Гипотонизацию, фиксацию клеток и приготовление препаратов хромосом производили согласно протоколу [7]. Окраску препаратов осуществляли красителем Гимза. При этом анализировали все виды аберраций хромосом, распознаваемых без кариотипирования.

Среди аберраций хромосомного типа учитывали парные ацентрики, (включающие фрагменты, относящиеся к классу терминальных делеций, и точки – интерстициальные делеции), центрические кольца и дицентрики. Эти виды аберраций относятся к классу нестабильных хромосомных аберраций. К дицентрику и центрическому кольцу относили по одному парному фрагменту или парные точки при отсутствии парных фрагментов. Точки и ацентрические кольца относятся к одному классу – интерстициальные делеции, и отличаются лишь размерами, поэтому при анализе данных их объединяли в один класс – точки. Стандартный метод метафаз-ного анализа (без кариотипирования) позволяет регистрировать и определенную часть, до 20% от их общего числа, стабильных аберраций в виде аномальных моноцентриков, являющихся в подавляющем числе случаев следствием симметричных (реципроктных) транслокаций.

Из аберраций хроматидного типа учитывали одиночные фрагменты, симметричные и асимметричные обмены. Последние при анализе объединяли в один класс – хроматидные обмены. Критерием отличия хроматидного фрагмента от пробела (gap) являлось смещение положения фрагмента относительно оси или длины хроматид.

Анализ стабильных аберраций в лимфоцитах крови человека производился методом селективной окраски хромосом (#2, #3, #8) – методом FISH. Образцы крови двух доноров мужского пола в возрасте 29 и 37 лет подвергались воздействию гамма-квантов 60Co в дозах от 0,25 Гр до 4,0 Гр. На каждую величину дозы было проанализировано суммарно от 580 до 3346 метафаз.

Культивирование клеток, приготовление препаратов и фиксацию выполняли по стандартной методике в соответствии с международными рекомендациями МАГАТЭ [7] с использовани- ем фитогемаглютинина (PHA M-form, Gibco) и фиксацией на 48 ч после начала культивирования. Для анализа стабильных аберраций хромосом использовали FISH-метод. При окраске FISH-методом применяли гибридизацию in situ с использованием в качестве зондов биотинилированные ДНК-пробы, специфичные к отдельным хромосомам человека, которые составляли 19,5% всего генома. Для контрастного окрашивания оставшихся хромосом применяли DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole).

При анализе части генома методом FISH оценка ожидаемой частоты аберраций с участием всех хромосом производилась в рамках гипотезы об однородном распределении первичных повреждений по генетическому материалу клетки. В этом случае частота аберрации на весь геном составляла F G =F P /N GE , где F P – парциальная частота аберраций с участием только «окрашенных» хромосом, N GE – число геном-эквивалентных клеток (клеточный эквивалент-GE). Эти величины связаны между собой известным соотношением N GE =fg N; fg=2,05 fp (1 - fp), где fp – доля генома, N – число проанализированных метафаз. В настоящем исследовании fg=0,322 [12]. При анализе методом FISH учитывали простые транслокации: полные, которые классифицировали при наличии двух окрашенных обменных моноцентриков, и неполные – с наличием только одного окрашенного обменного моноцентрика в анализируемой метафазе. Дицентрики, центрические кольца и парные фрагменты классифицировались по общей схеме.

В работе использовали перевиваемую культуру клеток китайского хомячка Cricetulus griseus линий CHO и CHO-К1 (Панэко) в экспоненциальной фазе роста – через 1 сутки после посева и в стационарной стадии роста, выращенную во флаконах Карреля без смены питательной среды в течение 5 суток, когда клетки достигают конфлюэнтности. В настоящем исследовании число хромосом в клетках данной линии варьируется от 17 до 20, а модальное число хромосом равно 18. Доля спонтанных полиплоидных клеток не превышает 6%. Клетки получены из банка клеточных культур МГЦ РАМН (Москва) в 2006 и 2008 гг. соответственно.

Посев клеток производили в закрытые резиновыми пробками флаконы Карреля с площадью основания 25 см2, содержащие 10 мл среды. Клетки культивировали при температуре 37 оС в среде DMEM (Панэко) с добавлением сыворотки крупного рогатого скота (КРС) и антибиотиков (пенициллин и стрептомицин в концентрации 50 ед/мл и 50 мг/мл соответственно). Для анализа частоты хромосомных аберраций добавляли 10% сыворотки КРС (Панэко). Для блокирования митоза на стадии метафазы за 2 часа до окончания инкубации во флаконы добавляли раствор демеколцина в концентрации 0,2 мкг/мл среды. Клетки снимали со стекла раствором трипсина-ЭДТА (ПанЭко) в течение 3 мин. Культуру клеток в растворе трипсина-ЭДТА переливали в центрифужные пробирки и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 2 мин для осаждения клеток. Надосадочную жидкость удаляли, добавляли предварительно подогретый до 37 оС гипотонический раствор (0,75 М KCl) и ресуспендировали в нём осадок. Далее пробирки с культурой клеток выдерживали на водяной бане (37 оС) 6 мин. По окончании гипотонизации вновь центрифугировали при тех же условиях с последующим удалением надосадочной жидкости.

Для фиксации клеток осадок ресуспендировали в 3 мл свежеприготовленного фиксатора (смесь метилового спирта и ледяной уксусной кислоты в пропорции 3 : 1) на шейкере в течение 1 мин. Смену фиксатора с последующим центрифугированием производили трижды. Препара- ты готовили непосредственно после окончания фиксации. Суспензию клеток капельно распределяли на смоченные дистиллированной водой, предварительно охлаждённые предметные стекла. После высыхания препараты гидролизовали в течение 10 мин в растворе соляной кислоты с концентрацией, равной 5 молярным долям (5 N). Окраска препаратов хромосом проводилась по методу Гимза. Цитогенетический анализ проводили на бинокулярном световом микроскопе CETI-N 101 B, SMT (Germany) под иммерсией при увеличении 100x10. Анализировали аберрации хромосомного типа (ацентрические фрагменты, центрические кольца и дицентрики) и хроматидного типа (делеции, изоделеции и обмены).

Выживаемость определялась стандартным методом подсчета макроколоний. Клетки культивировали в течение 12 суток в углекислотном инкубаторе MCO-5AC (производства фирмы Sanyo, Япония) при температуре 37 ^оС и 5% содержании CO 2 . Выжившими считались клетки, образующие колонии из 50 и более дочерних клеток. На каждую точку использовали не менее 3 флаконов Карреля.

Стандартные ошибки вычисляли для аберрантных клеток в предположении биномиального распределения, а для частоты аберраций – распределения Пуассона. В отдельных случаях ошибки оценивались по выборочным значениям. В качестве критерия значимости для проверки гипотезы о равенстве средних использовалась Z -статистика, без дополнительных предположений о дисперсиях исследуемых распределений. Наблюдаемые распределения аберраций по клеткам сравнивали с теоретически ожидаемым распределением Пуассона с помощью U -критерия [8]. Для получения интервальных оценок при биодозиметрическом анализе был использован подход, основанный на учёте 95% доверительных интервалов как для индивидуальной ошибки единичного измерения, так и для зоны регрессии среднего хода регрессионной зависимости [7].

Результаты исследования и обсуждение

Для решения поставленных в работе задач были проведены экспериментальные лабораторные исследования частоты радиационно-индуцированных аберраций хромосом в лимфоцитах крови здоровых доноров и клетках перевиваемой культуры китайского хомячка при облучении образцов in vitro . В целом представленные в статье результаты были получены в период 2000-2013 гг. в лаборатории радиационной цитогенетики ФГБУ МРНЦ Минздрава России (Обнинск).

В таблице 1 приведены результаты анализа радиационно-индуцированных нестабильных аберраций в лимфоцитах крови человека при у-облучении ⁶⁰Co в экспериментах in vitro . Результаты в диапазоне от 0 до 4,27 Гр включают цитогенетические данные, полученные от 1 до 4 доноров на величину каждой дозы.

В таблице 2 приведены результаты анализа радиационно-индуцированных нестабильных аберраций в лимфоцитах крови человека при облучении образцов крови нейтронами с энергией 14 МэВ с помощью импульсного нейтронного генератора ИНГ-03.

Таблица 1

Число нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови человека при облучении образцов донорской крови γ- квантами ⁶⁰Co в зависимости от дозы облучения ( данные 2010-2012 гг .)

Доза, Гр	Число метафаз	Число аберрантных клеток	Число фрагментов	Число центрических колец	Число дицен-триков	Частота ди-центриков /100 кле-ток±SE	Распределение дицентриков по клеткам						u	σ 2/y
							0	1	2	3	4	5
0	7799	17	16	0	1	0,013±0,013	7798	1	0	0	0	0	1,00	0,00
0,035	2000	16	15	0	1	0,05±0,05	1999	1	0	0	0	0	1,00	0,00
0,059	2000	16	11	0	6	0,30±0,12	1994	6	0	0	0	0	1,00	-0,09
0,089	2000	23	18	3	3	0,15±0,09	1997	3	0	0	0	0	1,00	-0,04
0,114	2000	17	11	2	5	0,25±0,11	1995	5	0	0	0	0	1,00	-0,07
0,128	2000	21	13	0	8	0,40±0,14	1992	8	0	0	0	0	1,00	-0,12
0,246	2000	18	11	1	7	0,35±0,13	1993	7	0	0	0	0	1,00	-0,10
0,294	1071	43	14	7	25	2,33±0,47	1046	25	0	0	0	0	0,98	-0,53
0,51	900	60	16	5	44	4,89±0,74	858	40	2	0	0	0	1,04	0,93
1,04	700	131	49	16	83	11,9±1,3	622	73	5	0	0	0	1,00	0,06
1,91	700	272	100	66	207	29,6±2,1	517	164	16	2	0	1	1,01	0,28
2,14	600	309	106	60	257	42,8±2,7	376	193	29	2	0	0	0,85	-2,68
3,42	300	231	129	54	246	82,0±5,3	120	121	53	5	1	0	0,78	-2,64
4,27	600	551	362	282	812	135,3±4,8	137	221	159	63	16	4	0,84	-2,77

Таблица 2

Число нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови человека при облучении образцов донорской крови нейтронами с энергией 14 МэВ в зависимости от дозы облучения ( данные 2009 г .)

Доза, Гр	Число метафаз	Число аберрантных клеток	Число фрагментов	Число центрических колец	Число дицен-триков	Частота ди-центриков /100 кле-ток±SE	Распределение дицентриков по клеткам						u	σ 2/y
							0	1	2	3	4	5
0	760	1	0	0	1	0,13±0,13	759	1	0	0	0	0	0,00	1,00
0,2	500	48	25	2	25	5,0±1,0	452	44	4	0	0	0	-0,78	0,95
0,5	320	53	38	2	24	7,50±1,53	269	41	7	3	0	0	1,23	1,10
1	250	102	52	22	62	24,8±3,2	148	71	28	3	0	0	-0,93	0,92
2	150	101	46	22	90	60,0±6,3	49	58	30	12	1	0	-1,11	0,87

В таблицах 1 и 2 приведены просуммированные по дозовым интервалам результаты для числа дицентриков в лимфоцитах крови человека в зависимости от поглощённой дозы. Для каждой дозы выполнен анализ распределения дицентриков по клеткам с оценкой его соответствия распределению Пуассона. В последних двух колонках приведена относительная дисперсия (σ ²/Y ) и параметр u [8]. При u <1,95 распределение соответствует Пуассоновскому. В настоящей работе были исследованы по отдельности дозовые зависимости общей частоты нестабильных аберраций и частоты дицентриков с целью использования этих зависимостей в задачах биологической дозиметрии или индикации лучевого воздействия.

В таблице 3 приведены объединённые в дозовые группы результаты анализа стабильных аберраций в лимфоцитах крови человека при γ-облучении 60Co in vitro. Дозовые группы в диапазоне от 0 до 5 Гр включают данные для образцов крови от двух доноров каждая – в таблице 3 они разделены сплошными горизонтальными линиями. Суммарные результаты по группе выделены жирным шрифтом. Здесь же представлены полные (tc) и неполные (ti) транслокации, а также терминальные делеции (TD), проанализированные методом FISH. Результаты анализа аберраций в образцах крови двух доноров суммированы для каждой дозы. В колонке «число метафаз» представлено общее число проанализированных метафаз и число клеточных эквивалентов в круглых скобках. Для каждой дозы рассчитаны соответствующие значения частоты аберраций на 100 клеток и ошибка среднего.

Таблица 3 Число стабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови человека при облучении образцов донорской крови γ- квантами ⁶⁰Co в зависимости от дозы облучения ( данные 2000 г ., метод FISH)

Доза, Гр	Донор №	Число метафаз (N GE )*	Полные транслокации	Сумма всех транслокаций	Терминальные делеции
	1	2045	3	4	3
0	2	1301	4	4	1
	всего	3346 (1101)	0,64±0,24**	0,73±0,26	0,36±0,18
	1	2000	3	12	6
0,25	2	-	-	-	-
	всего	2000 (658)	0,46±0,26	1,82±0,53	0,91±0,37
	1	1000	5	9	5
0,5	2	338	4	7	4
	всего	1338 (440)	2,04±0,68	3,63±0,91	2,04±0,68
	1	1000	16	23	12
1,0	2	-	-	-	-
	всего	1000 (329)	4,86±1,22	6,99±1,46	3,65±1,05
	1	250	15	22	11
2,0	2	462	25	43	15
	всего	712 (234)	17,08±2,70	27,75±3,44	11,10±2,18
	1	300	31	40	12
3,0	2	293	28	44	17
	всего	593 (195)	30,24±3,94	43,06±4,70	14,86±2,76
	1	393	49	65	16
4,0	2	187	38	51	12
	всего	580 (191)	45,59±4,89	60,79±5,64	14,67±2,77

* N GE – число проанализированных геном-эквивалентных метафаз;

** частота аберраций на 100 геном-эквивалентных метафаз.

Представленные в таблице 3 частоты стабильных аберраций были использованы для анализа соответствующих дозовых зависимостей наблюдаемых стабильных аберраций, а также радиационно-индуцированного компонента. Таким образом, были получены уравнения регрессии для важной в ретроспективной биологической дозиметрии зависимости суммы полных и неполных транслокаций от дозы, а также аналогичная зависимость для радиационно-индуцированных транслокаций.

В таблице 4 представлены результаты анализа нестабильных аберраций в клетках китайского хомячка линии CHO-K1 при их облучении в стационарной стадии роста γ-квантами ⁶⁰Co в экспериментах in vitro . Результаты по дозе в диапазоне от 0 до 6 Гр были получены при двух сроках фиксации клеток после облучения: через 19 и 24 ч после облучения. Исследования проводили параллельно экспериментам с облучением клеток на ускорителе И-100 (Протвино) для изучения относительной биологической эффективности протонов с энергией 73 МэВ [3].

Таблица 4

Число нестабильных хромосомных аберраций в клетках китайского хомячка линии CHO-K1 при облучении в стационарной стадии роста γ- квантами ⁶⁰Co в зависимости от дозы облучения при различных сроках фиксации ( данные 2008-2009 гг .)

Доза, Гр	Число метафаз	Число аберр. клеток*	Хромосомные аберрации			Хроматидные аберрации
			дицентрики	центрич. кольца	фрагменты
фиксация через 19 ч
0	596	4	3	1	0	0
0,4	597	11	9	0	2	5
0,5	200	4	4	0	0	1
0,8	396	18	13	2	3	5
1	200	9	5	1	3	1
1,6	394	53	39	7	12	0
2	200	34	20	7	9	0
3	396	139	123	22	34	7
4	396	193	172	38	45	13
5	200	119	131	31	18	8
6	496	393	547	104	143	28
фиксация через 24 ч
0	593	3	1	0	0	0
0,4	394	12	7	2	3	3
0,5	200	5	5	0	0	0
0,8	395	19	14	1	7	6
1	200	10	6	2	3	0
1,6	395	58	42	12	8	3
2	200	23	21	2	5	0
3	492	150	128	24	38	12
4	395	194	188	39	38	16
5	200	105	116	22	17	7
6	390	334	424	92	206	39

* число клеток, содержащих аберрации хромосомного типа.

В таблице 5 представлены результаты анализа нестабильных аберраций в клетках китайского хомячка линии CHO-K1 при их облучении в стационарной стадии роста протонами с энергией 73 МэВ в экспериментах in vitro на ускорителе И-100 (Протвино). Результаты по дозе в диапазоне от 0 до 6,3 Гр были получены при аналогичных двух сроках фиксации клеток после облучения – через 19 ч и 24 ч. В работе были исследованы как дозовые зависимости общей частоты нестабильных аберраций, так и частоты дицентриков, необходимые для оценки относительной биологической эффективности протонов с энергией 73 МэВ при различных дозах облучения.

В таблице 6 представлены результаты анализа нестабильных аберраций в клетках китайского хомячка линии CHO-K1 при их облучении в экспоненциальной стадии роста γ-квантами ⁶⁰Co в экспериментах in vitro . Результаты по дозе в диапазоне от 0 до 4,5 Гр были получены при фиксации клеток после облучения на 24 ч. Исследования проводили параллельно экспериментам с облучением клеток на импульсном нейтронном генераторе ИНГ-03 (МРНЦ) для изучения относительной биологической эффективности нейтронов с энергией 14 МэВ.

В работе были исследованы по отдельности дозовые зависимости общей частоты нестабильных аберраций и частоты дицентриков с целью оценки относительной биологической эффективности нейтронов с энергией 14 МэВ при различных дозах облучения.

Таблица 5

Число нестабильных хромосомных аберраций в клетках китайского хомячка линии CHO-K1 при облучении в стационарной стадии роста протонами с энергией 73 МэВ в зависимости от дозы облучения при различных сроках фиксации ( данные 2008-2009 гг .)

Доза, Гр	Число метафаз	Число аберр. клеток*	Хромосомные аберрации			Хроматидные аберрации
			дицентрики	центрич. кольца	фрагменты
фиксация через 19 ч
0	597	4	3	0	1	0
0,32	396	22	13	3	6	2
0,56	200	8	6	2	0	3
0,7	391	31	18	9	7	5
1,13	200	15	11	2	2	5
1,61	396	89	69	12	23	4
2,24	200	59	49	9	10	7
3	200	90	79	22	13	5
3,08	198	105	112	22	37	4
3,84	200	90	81	20	30	7
4	195	142	166	35	48	13
4,87	200	132	161	33	23	6
5,92	493	391	557	84	122	27
6,3	300	248	353	76	64	17
фиксация через 24 ч
0	596	5	4	1	0	2
0,32	394	18	15	0	3	2
0,56	200	13	11	1	1	0
0,7	394	36	28	6	5	6
1,13	200	21	16	4	3	7
1,61	396	117	101	19	18	4
2,24	200	39	28	12	13	5
3	200	69	55	19	13	7
3,08	194	115	118	14	35	14
3,84	200	107	90	28	34	4
4	195	135	134	33	64	9
4,87	200	128	139	34	43	11
5,92	247	217	345	70	106	17

* число клеток, содержащих аберрации хромосомного типа.

Таблица 6

Число нестабильных хромосомных аберраций в клетках китайского хомячка линии CHO-K1 при облучении в экспоненциальной стадии роста γ- квантами ⁶⁰Co и нейтронами с энергией 14 МэВ в зависимости от дозы облучения при фиксации на 24 ч ( данные 2012-2013 гг .)

Доза, Гр	Число метафаз	Число аберр. клеток*	Хромосомные аберрации			Хроматидные аберрации
			дицентрики	центрич. кольца	фрагменты
γ-кванты 60Co
0	298	3	2	0	1	0
1	100	7	6	1	2	3
2	100	20	16	1	4	2
2,2	50	24	17	3	8	6
3	100	25	23	1	4	1
4	100	36	30	2	6	4
4,5	50	28	29	5	12	6
нейтроны 14 МэВ
0	298	3	2	0	1	0
2,2	95	62	50	5	26	19
4,5	54	53	75	4	31	11

* число клеток, содержащих аберрации хромосомного типа.

В таблице 7 представлены результаты оценки выживаемости клеток китайского хомячка линии CHO при их облучении в стационарной стадии роста γ-квантами ⁶⁰Co в экспериментах in vitro. Также в данной таблице представлены оценки выживаемости клеток китайского хомячка линии CHO-K1 при их облучении в экспоненциальной стадии роста γ-квантами ⁶⁰Co и нейтронами с энергий 14 МэВ. В работе были исследованы дозовые зависимости выживаемости клеток китайского хомячка линии CHO-K1 с целью оценки относительной биологической эффективности нейтронов с энергией 14 МэВ.

Таблица 7

Оценка выживаемости клеток китайского хомячка при облучении линии CHO в стационарной стадии роста (S- фаза ) γ- квантами ⁶⁰Co ( данные 2006 г .) и линии CHO-K1 в экспоненциальной стадии роста (L- фаза ) γ- квантами ⁶⁰Co и нейтронами с энергий 14 МэВ ( данные 2012-2013 гг .) в зависимости от дозы облучения

Доза, Гр Число высеянных клеток Число выживших клеток (повторности) Величина выживаемости, (%) ±SE CHO, S-фаза , γ-кванты 60Co, 2006 г. 500 153 145 140 500 132 128 145 0 500 170 147 145 100 500 131 125 122 1000 240 269 235 1000 200 198 255 1 1000 233 194 192 78,3±1,1 1000 204 213 203 1500 236 262 253 1500 214 211 202 2 1500 302 245 262 56,0±1,0 1500 210 206 225 2000 208 237 280 2000 174 150 - 4 2000 287 227 - 38,2±1,1 2000 195 198 185 CHO-K1, L-фаза, γ-кванты 60Co, 2012-2013 гг. 0 300 180 210 100 1 600 322 387 90,9±8,9 2 1200 365 383 47,9±7,1 2,2 500 232 62,7±7,1 3 1800 276 287 24,1±7,1 4 2400 165 174 10,9±7,1 4,5 1000 252 34,1±7,1 CHO-K1, L-фаза, 14 МэВ нейтроны, 2012-2013 гг. 0 500 370 425 100 0,78 500 252* 63,4±5,5 1,39 1000 260* 32,7±5,5 2,2 500 132* 33,2±5,5 2,95 1000 145* 18,2±5,5 4,5 1000 49* 6,2±5,5 среднее число колоний по трём посевам.

В работе была исследована дозовая зависимость частоты стабильных аберраций в лимфоцитах крови человека при помощи стандартной линейно-квадратичной модели. Результаты оценки соответствующих регрессионных коэффициентов приведены в таблице 8. Коэффициенты были оценены для полных наблюдаемых транслокаций, суммы полных и неполных транслокаций и частоты радиационно-индуцированных транслокаций. Последние оценивали путём вычитания из наблюдаемой частоты спонтанного уровня, равного свободному слагаемому «a». Известно, что частота спонтанных транслокаций существенно зависит от возраста человека, поэтому дозовая зависимость индуцированных транслокаций обладает свойством универсальности в задачах ретроспективной биодозиметрии. Приведенные в таблице 8 оценки выполнены с учётом экстраполяции частоты аберраций на полный геном по известной формуле Лукаса [12].

Таблица 8

Коэффициенты регрессионной дозовой зависимости частоты стабильных аберраций в лимфоцитах крови человека при облучении γ- квантами ⁶⁰Co

Тип аберраций	Коэффициенты регрессии, (аберр./100кл/GE)
	a, ±SE	α, Гр-1 ±SE	β, Гр-2 ±SE
Транслокации полные (наблюдаемые)	0,43±0,22	0,89±1,03	2,87±0,41
Сумма транслокаций (наблюдаемые)	0,67±0,25	4,59±1,33	2,92±0,51
Сумма транслокаций (индуцированные)	-	4,53±1,25	2,93±0,50

Y=a+α⋅D+β⋅D2⋅Т – (табл. 3).

В работе была исследована дозовая зависимость частоты нестабильных аберраций в лимфоцитах крови человека и в клетках китайского хомячка при помощи линейно-квадратичной модели следующего вида: Y = a +α⋅ D +β⋅ D ² , где D – поглощённая доза, Y – частота аберраций, a , α , β – коэффициенты регрессии. Зависимость такого типа следует из гипотезы относительно механизма образования аберраций, которая состоит в том, что линейное слагаемое ( α⋅ D ) описывает аберрации вследствие воздействия одного трека, тогда как квадратичное слагаемое ( β⋅ D ² ) описывает аберрации вследствие одновременного воздействия двух треков. При этом два первичных повреждения, необходимые для образования дицентриков, могут являться следствием воздействия как одного, так и нескольких треков ионизирующих частиц. Ацентрические аберрации могут являться следствием как одного, так и множественных первичных повреждений хромосом. При этом при переходе к плотноионизирующим излучениям возрастает вероятность образования множественных первичных повреждений в одном треке, что сказывается на величине линейного слагаемого ( α⋅ D ) в дозовой зависимости частоты аберраций.

В настоящем исследовании для оценки ОБЭ использовали показатели общей частоты хромосомных аберраций и частоты дицентриков (частота аберраций на 100 клеток) в соответствии со следующими формулами:

Y γ = a γ + α γ D + β γ D ²

YX = aX +αXD+βXD2

ОБЭ ( D ) =