Анализ экспрессии GFAP в пирамидном слое гиппокампа крыс при экспериментальном моделировании стеноза общих сонных артерий

Среди множества функций астроцитарной глии, возможно, первостепенное значение имеет нейропротективная. Так, известно о роли астроцитов в защите от эксайтотоксического эффекта за счет активного удаления внеклеточного глутамата из синаптической щели [1, 2]. Помимо этого, астроциты принимают участие в регулировании концентрации внеклеточных ионов калия, синтезе и метаболизме ряда нейротрофических факторов, а также ангиогенезе [1]. Нейропротективная способность астроцитов может иметь решающее значение для ограничения степени ишемического повреждения и стать важным шагом к сосредоточению внимания на этих клетках как многообещающей мишени для терапии [3, 4].

Активация астроцитарной глии описана при различных патологических процессах, в том числе при ишемии головного мозга. Под активированными астроцитами понимается изменение фенотипа с перестройкой, в том числе основных белков цитосклета [1, 5].

К одним из важнейших промежуточных филаментов относится глиальный фибриллярный кислый белок (glial fibrillary acidic protein, GFAP). Участие в репаративных процессах, предполагаемое влияние на нейрогенез, значимая роль в направленном росте астроцитарных отростков и построении синаптических контактов обуславливают актуальность всестороннего изучения GFAP при хронической ишемии головного мозга [3, 6].

Имеются сведения о сниженной способности нейронов к выживанию, большем объеме повреждения и нарушенной нейропластичности у мышей с нокаутом GFAP на модели временной окклюзии средней мозговой артерии [7]. На модели фокальной ишемии головного мозга продемонстрирована усиленная экспрессия GFAP в СА1 гиппокампа, при этом GFAP-имму-нопозитивные астроциты одновременно усиленно экспрессировали даблкортин; в других исследованиях при моделировании ишемии выявлено усиление экспрессии GFAP в астроцитарной глии стриатума и черной субстанции, также несущей на себе метки делящихся про-гениторных клеток [8, 9].

Имеющиеся в литературе данные о функциях и роли GFAP при хронической ишемии головного мозга немногочисленны и во многом противоречивы, что актуализирует дальнейшее изучение.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Качественными и количественными методами описать особенности экспрессии GFAP в пирамидном слое гиппокампа крыс при экспериментальном моделировании стеноза общих сонных артерий.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 25 белых крысах-самцах. Животные были разделены на две группы: 1-я – контрольные крысы (n = 10), 2-я – крысы с моделируемым нарушением кровообращения (n = 15). Стеноз общих сонных артерий моделировался путем частичного ограничения кровотока с помощью наложения лигатур. Наркотизированное животное фиксировали, область шеи выбривали, обрабатывали 0,05%-м раствором хлоргексидина биглюконата. После выделения сонной артерии под нее подводили три лигатуры, располагаемые на расстоянии 2–3 мм друг от друга. Параллельно артерии закрепляли иглу (29G 1/2) от шприца (SFM Hospital Products GmbH, Германия), к которой привязывалась сонная артерия и которая затем убиралась таким образом, чтобы лигатуры оставались на заданном расстоянии. Оценку уровня локального кровотока осуществляли до и после стенозирования сонной артерии в двух точках, в месте сразу после наложения лигатур и в проекции средней мозговой артерии. После операции рану послойно ушивали, обрабатывали 0,05%-м раствором хлоргексидина биглюконата и 5%-м раствором йода, животных переносили в домашние клетки.

Через 20 дней после операции оценивалось психоневрологическое состояние, сохранность рефлексов, поведение и двигательная активность [10]. На 22-е сутки животных выводили из эксперимента с применением в качестве наркоза хлоралгидрата (400 мг/кг, интраперитонеально), декапитировали гильотинным методом, получали образцы головного мозга. Образцы головного мозга животных фиксировали в 10%-м растворе формалина, приготовленном на 0,2 mМ фосфатном буфере с дальнейшей гистологической проводкой и изготовлением серийных парафиновых срезов толщиной 5 мкм, которые окрашивали по стандартным методикам гематоксилином и эозином, тионином по Нисслю. При морфометрическом исследовании подсчитывали показатель удельного количества нейронов с признаками повреждения.

К признакам повреждения относили ги-перхромию ядра и цитоплазмы, веретеновидное сморщивание перикариона нейрона, деформацию перикариона нейрона в сочетании с гиперхромией ядра и цитоплазмы, а также гипохромию клетки (клетки-тени).

Иммуногистохимическое исследование проводили непрямым пероксидазно-антиперок-сидазным методом с использованием антител к GFAP (ready to use) согласно протоколу производителя, с использованием полимерной системы (Thermo Scientific, Fremont, CA). В качестве хромогена использовали DAB (диаминобензидин). Оценку изменения уровня экспрессии определяли путём подсчёта относительной площади (ОП) иммунопозитивного материала (ИМ) во всех зонах гиппокампа с использованием модуля Image Analysis программы ZEN 1.1.2.0 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany). Исследование микропрепаратов проводилось с помощью микроскопа «Axio Lab. A1» (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany), фотодокументирование осуществляли камерой «AxioCam 105 color» (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany).

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов программ Statistica 6,0 (StatSoft, USA). Обобщенные данные представляли в виде медианы (Me) с указанием интерквартильного интервала [Q1;Q3]. Различия между группами оценивали по критерию Манна – Уитни (Mann – Whitney, U-test) и считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При гистологическом исследовании пирамидного слоя гиппокампа животных 2-й группы в СА1 было отмечено увеличение удельного количества нейронов с признаками повреждения, большинство среди которых составляли гиперхромные в сочетании с пикноморфной деформацией перикариона.

Удельное количество нейронов с признаками повреждения составило в этой зоне 31,2 [22,4; 41] %, что на 23 % больше по сравнению с группой 1 (см. табл.). Иммуногистохимическое исследование СА1 пирамидного слоя гиппокампа крыс с моделируемым стенозом сонных артерий с применением антител против GFAP не выявило достоверных отличий от контроля в относительной площади иммунопозитивного материала.

При гистологическом исследовании СА2 гиппокампа крыс 2-й группы достоверных отличий в удельном количестве поврежденных нейронов от контрольной группы не было выявлено. Наблюдались микроциркуляторные нарушения в виде умеренного перицеллюлярного и периваскулярного отека, единичных диапедез-ов эритроцитов и эритроцитарных стазов. При иммуногистохимическом исследовании СА2 пирамидного слоя гиппокампа крыс с моделируемым стенозом сонных артерий с применением антител против GFAP обнаружено увеличение экспрессии, увеличение ОП GFAP-позитивного материала составило здесь по сравнению с контролем 6,3 % (p < 0,01) и достигло 10,3 [7,8; 12,6] % (рис. 1). При гистологическом исследовании СА3 пирамидного слоя гиппокампа крыс 2-й группы обнаружено достоверное увеличение удельного количества поврежденных нейронов на 8,7 % по сравнению с контролем (p < 0,01) (см. табл.). Цитоархитектоника СА3 пирамидного слоя имела схожий характер с зонами СА1 и СА2, среди поврежденных пирамидных нейронов преобладали гиперхромные в сочетании с веретеновидно сморщенными перикарионами. При иммуногистохимическом исследовании СА3 пирамидного слоя гиппокампа крыс с моделируемым стенозом сонных артерий выявлено максимальное среди всех зон увеличение относительной площади GFAP-позитивного материала – на 6,6 % по сравнению с контролем (p < 0,001).

В СА3 сохранялась характерная для СА1 и СА2 картина расположения астроцитов – преимущественно за пределами пирамидного слоя, в пирамидном слое присутствуют активно ветвящиеся астроцитарные отростки (рис. 2). При гистологическом исследовании СА4 пирамидного слоя гиппокампа крыс 2-й группы достоверных отличий в удельном количестве поврежденных нейронов не выявлено, микроциркуляторные расстройства имели тот же характер, что и в остальных зонах: умеренный периваскулярный и перицеллюлярный отек, единичные эритроцитарные диапедезы. При иммуногистохимическом исследовании в пирамидном слое СА4 крыс 2-й группы также выявлено достоверное увеличение относительной площади GFAP-позитивного материала – на 3,3 % по сравнению с контролем (p < 0,001), таким образом, данный показатель составил 5,6 [5,1; 7] % (см. табл.). Как и в остальных зонах, в СА4 характер экспрессии был преимущественно выраженным.

Изменение удельного количества пирамидных нейронов с признаками повреждения и относительная площади GFAP-позитивного материала в пирамидном слое гиппокампа крыс с моделируемым стенозом общих сонных артерий

Параметр	Контроль				Моделируемый стеноз общих сонных артерий
	СА1	СА2	СА3	СА4	СА1	СА2	СА3	СА4
Удельное количество нейронов с признаками повреждения, %	8,2 [6,8; 9,7]	6,8 [4,5; 8,9]	6,3 [4,6; 9]	4,4 [2,9; 7,0]	31,2 [22,4; 41]***	10,2 [7,1; 18]	15 [8,2; 22,1]**	7,7 [3; 10,2]
Относительная   пло щадь ИРМ, GFAP, %	5,1 [4,2; 6,5]	4,0 [2,2; 5,0]	1,5 [1,0; 2,6]	2,3 [1,8; 2,7]	9,8 [6,1; 11,3]	10,3 [7,8; 12,6] **	8,1 [5,3; 9,4] ***	5,6 [5,1; 7] ***

Примечание: *** p < 0,001 – различия достоверны по сравнению с контрольной группой, ** р < 0,01 – различия достоверны по сравнению с контрольной группой (использован критерий Манна – Уитни). Данные представлены в виде медианы с указанием интерквартильного размаха (Me [Q1; Q3]).

Рис. 1. Динамика изменения относительной площади GFAP-позитивного материала при моделировании стеноза общих сонных артерий:

*** – р < 0,001, ** – р < 0,01 – различия достоверны по сравнению с контрольной группой (использован критерий Манна – Уитни)

Рис. 2. Иммуногистохимическое исследование СА3 зоны гиппокампа крыс с применением антител против GFAP: А – контрольная группа; Б – группа крыс с моделируемым стенозом общих сонных артерий, увеличение площади и усиление интенсивности ИРМ. Ув. ×400, докраска гематоксилином

Выявленное нами достоверное увеличение относительной площади GFAP-позитивного материала в СА2, СА3 и СА4 пирамидного слоя гиппокампа крыс с моделируемым стенозом сонных артерий свидетельствует об активации астроцитарной глии, что согласуется с литературными данными, описывающими подобный астроглиальный ответ у крыс на различных моделях ишемии головного мозга [8, 9, 11]. Мы полагаем, что в гиппокампе крыс из обеих экспериментальных групп развивается реактивный астроглиоз, имеющий адаптивный характер и направленный на формирование глиального рубца с ограничением зоны поражения, а также и на трофическую поддержку нейронов в условиях ишемии. Выявленное достоверное увеличение удельного количества поврежденнных нейронов в зонах СА1 и СА3 пирамидного слоя гиппокампа крыс свидетельствует о большей чувствительности этих зон к хронической ишемии, вызванной стенозированием сонных артерий по сравнению с зонами СА2 и СА4 [12, 13].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, при экспериментальном моделировании стеноза сонных артерий в СА2, СА3 и СА4 пирамидного слоя гиппокампа крыс отмечается достоверное усиление экспрессии GFAP, при этом в СА3 увеличение относительной площади GFAP-позитивного материала сопровождается достоверным увеличением количества поврежденных нейронов, что свидетельствует о развитии адаптивных изменений, реактивной активации астроцитов и формировании глиального рубца.