Анализ экспрессии миРНК и мРНК в клеточном материале слизистой оболочки желудка, полученного при эзофагогастродуоденоскопии, для выявления дисплазии и рака желудка



В качестве одного из способов получения материала при эзофагогастродуоденоскопии может быть использована браш-биопсия. Соскоб нейлоновой щеткой позволяет получить материал с большой площади собственной пластинки слизистой оболочки и не приводит к фиброзу, а само цитологическое исследование может быть альтернативой гистологическому.При одновременном применении цитологического исследования и дополнительных методик (иммуноцитохимия, селективные окраски, молекулярные исследования) эффективность диагностики,согласно данным литературы, приближается к 100% [6]. Немаловажно и то, что цитологическое заключение может быть получено значительно раньше, чем морфологическое [6,7]. Однако у цитологического исследования есть свои «переделы возможности», прежде всего, это невозможность увидеть инвазию при подозрении на злокачественный характер, к тому же стекла-мазки не всегда обеспечивают репрезентативность разных участков гетерогенной опухоли, а сам клеточный материал чувствителен к внешним воздействиям. Большинство препаратов утрачивают мелкие структурные детали,если от момента приготовления препарата до его окрашивания прошло более 6 часов. [6]. Для повышения точности и надежности диагностики,в дополнение к цитологическому анализу, было бы желательно анализировать образцы на другие типы маркеров. В их качестве могут выступать как матричные РНК (мРНК) белок-кодирующих генов, так и микроРНК (миРНК).

Кроме миРНК в данной работе мы использовали мРНК в качестве маркеров трансформации клеток.

мРНК содержат информацию о последовательности аминокислот в белке и являются посредниками, переносящими информацию из ядра в цитоплазму. На посттранскрипционном уровне миРНК регулируют экспрессию генов за счет спаривания со специфическими нуклеотидными последовательностями мРНК [11].

Материалы и методы

Выделение суммарной РНК. Цитологический препарат переносили со стекла в пробирку и добавляли 600 мкл лизирующего буфера (4 М гуанидин изотиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,3% саркозил, 3% ДТТ), расфасованного в бескислородной атмосфере (АО “Вектор-Бест”, Россия). Пробирки помещали в термошейкер на 10 мин при 65о С. Раствор центрифугировали 2 мин. при 10 000 g., переносили супернатант в новые пробирки и добавляли к нему равный объем изопропанола, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 5 мин. Центрифугировали 10 мин при 12 000 g, супернатант сливали, осадок промывали: 500 мкл 70% этанола, затем 300 мкл ацетона. РНК растворяли в 200 мкл деионизованной воды.

Выбор набора молекулярных маркеров. Из своей предыдущей работы мы использовали 7миРНК–марке-ров злокачественности (миРНК-145-5p, -150-5p, -21,-20a, -31-5p, -34a-5p, -375), для которых в качестве референса использовалась малая ядерная РНК U6. В данной работе мы добавили к ним миРНК-106b, -125b, -196b выбранные на основании анализа доступной литературы. Помимо миРНК, в данной работе в качестве маркеров были использованы мРНК следующих генов: TERT, CDKN2A, CKS2, FN1 с нормировкой на ген PGK1.

Детекция миРНК и мРНК с помощью ОТ-ПЦР-РВ. Для выявления зрелых миРНК и малой РНК U6 использовали метод, предложенный Chen C. и соавторами в 2005 году [15]. Метод включает в себя обратную транскрипцию зрелой миРНК с помощью длинного праймера со шпилькой,с последующей детекцией полученной кДНК с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) (Chen C., 2005). Для каждой миРНК отдельно проводили реакцию обратной транскрипции с последующей ПЦР-РВ.Нормировку содержания миРНК проводили на содержание малой ядерной РНК U6 в образце с помощью метода 2-ΔCq [16]. Выявление мяРНК U6 проводилось по той же схеме stem-loop ОТ-ПЦР, которая использовалась для миРНК.

Полуколичественную оценку содержания мРНК проводили методом ОТ-ПЦР-РВ со специфическими праймерами и флуоресцентно-мечеными зондами для выявления мРНК соответствующих генов и гена PGK1 (фосфоглицераткиназа), используемого в качестве нор- мализатора. Уровень относительной экспрессии рассчитывали с помощью метода 2-ΔCq.

Статистическую обработку данных проводили в программе STATISTICA 10 (StatSoft Inc., США) и Excel (Microsoft, США). Сравнение двух независимых выборок по количественному признаку проводили при помощи критерия Манна-Уитни. Критический уровень значимости был принят равным 0,0012 с учетом поправки Бонферрони.Стратификацию образцов на разные группы проводили с помощью алгоритма построения дерева принятия решений C5.0.

Результаты

С помощью ОТ-ПЦР-РВ мы определили экспрессию 10 классификаторных миРНК и 4 мРНК в 221 цитологическом образце. В таблице 1 приведены данные по статистической значимости различий между экспрессией миРНК и мРНК между группами норма/рак/дисплазия. Попарное сравнение было выполнено с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.

Из таблицы 1, видно, что в случаях миРНК-125b, 145, -196b, -21, -375 и мРНК TERT, СKS2, FN1 достигнут высокий уровень значимости различий в группе рак/норма; миРНК-375 и мРНК FN1 в группе рак/дисплазия и миРНК-145, -196b, -20a, мРНК СKS2, TERT в группах норма/дисплазия.

На основании данных, относящихся к цитологиче- ским образцам, было построено новое дерево принятия решения, с использованием алгоритма C5.0:

миР-375 <= -14.273:Диагноз = Рак миР-375 > -14.273:

:...CKS2 > 1.853221: Диагноз = Норма

CKS2 <= 1.853221:

:...миР-196b <= -30894.83: Диагноз = Норма миР-196b > -30894.83:

:...миР-145 > -37.9232:

:...FN1 > 0.2643117: Диагноз = Рак

: FN1 <= 0.2643117:

:   TERT > 0.02677348: Диагноз = Норма миР-145 <= -37.9232:

:...миР-125b > -9.207474: Диагноз = Дисплази миР-125b <= -9.207474:

:...FN1 <= 0.01168407: Диагноз = Норма

FN1 > 0.01168407:

TERT > 0.00008631:

:...миР-145 <= -412.5019: Диагноз = Дисплазия миР-145 > -412.5019:

:...миР-20a > -4.228479: Диагноз = Рак миР-20a <= -4.228479:

:...миР-21 <= 1.656485: Диагноз = Рак миР-21 > 1.656485: Диагноз = Дисплазия

Таблица 1.

Уровень значимости при попарном сравнении экспрессии миРНК и мРНК в цитологических образцах Table 1.

Significance level for pairwise comparison of miRNA and mRNA expression in cytological samples

миРНК	РЖ/Норма	РЖ/Дисплазия	Норма/Дисплазия
миРНК-125b	5,56*10-6	0,5491	0,0620
миРНК-145	1,87*10-8	0,1165	4,84*10-9
миРНК-196b	1,62*10-12	0,0486	0,0005
миРНК-20a	0,0713	0,0928	0,0002
миРНК-150	1,03*10-9	0,3557	1,93*10-5
миРНК-21	4,40*10-10	0,0385	0,0079
миРНК-375	5,08*10-9	2,93*10-9	0,0007
миРНК-106b	0,5174	0,3674	0,5609
миРНК-31	3,71*10V	0,0281	0,0475
миРНК-34а	3,74*10-7	0,6937	6,80*10-5
мРНК TERT	4,34*10-8	0,4407	2,26*10-5
мРНК СKS2	2,78*10-11	0,4490	2,15*10-7
мРНК FN1	2,18*10-12	2,38*10-5	0,4705
мРНК CDKN2A	1,48*10-5	0,1868	0,1033

Примечание. Жирным шрифтом выделены значимые (p<0,0012) различия Note. Significant (p <0.0012) differences are in bold

Таким образом, в дерево решений вошли миРНК-125b, -145, -196b, -21, -20a и -375 и мРНК генов СKS2 TERT и FN1 т.е. все, для которых были показаны достоверные отличия в экспрессии.

Диагностические характеристики выявления рака и дисплазии с помощью этого дерева принятия решения представлены в таблице 2.

Из 108 образцов рака классификатор отнес 105 образцов (97,2%) к раку, 2 (1,9 %) к дисплазии и 1 (0,9 %) к норме.

Обсуждение

Из таблицы 3 следует, что существуют различия между гистологическим и цитологическим материалом по экспрессии семи миРНК. Часть из них связана с разными структурами выборок: в работе по гистологическому материалу было 34 образца рака, 54 дисплазии и 34 нормы, а в данной работе (по цитологическому материалу): 108 образцов рака, 27 дисплазии и 86 нормы. Т.е. соотношение между группами получается разным, размер выборки тоже отличается. Кроме того, материал для гистологического исследования фиксирован в 10%-ном

Таблица 2.

Диагностические характеристики выявления рака и дисплазии на основании данных об экспрессии мРНК и миРНК в цитологических образца

Diagnostic characteristics of detecting cancer and dysplasia based on data on the expression of mRNA and miRNA in cytological samples

Table 2.

Таблица 3.

Сопоставление уровней значимости различий между группами для цитологического и гистологического материала Table 3.

Comparison of significance of differences between groups for cytological and histological material

миРНК	РЖ/Норма		РЖ/Дисплазия		Норма/Дисплазия
	Гистология	Цитология	Гистология	Цитология	Гистология	Цитология
миР-145	0,658799	1,87*10-8	0,0244	0,1165	0,020678	4,84*10-9
миР-150	0,001427	1,03*10-9	2,39*10-9	0,3557	1,6*10-12	1,93*10-5
миР-20a	0,0870	0,0713	0,0053	0,0928	1,84*10-4	0,0002
миР-21	1,62*10-7	4,40*10-10	0,0024	0,0385	7,27*10-9	0,0079
миР-31	0,397360	3,71*10-7	1,0*10-6	0,0281	1,19*10-10	0,0475
миР-34a	4,69*10-11	3,74*10-7	0,007694	0,6937	1,89*10-11	6,80*10-5
миР-375	0,001012	5,08*10-9	7,0*10-6	2,93*10-9	0,078223	0,0007

Частично по этим причинам из семи миРНК, вошедших в гистологический классификатор, в цитологический вошли только три: миРНК-145, -21 и -375. В большей степени в цитологический классификатор вошли новые маркеры: миРНК-125b, -196b и мРНК TERT, CKS2, FN1, для которых получились различия с высоким уровнем значимости между группами рак/норма и дисплазия/норма. Между группами рак/дисплазия значимые различия оказались только для двух маркеров (миРНК-375, мРНК FN1), поэтому при высокой специфичности выявления дисплазии, чувствительность оказалась заметно ниже. Результаты морфологического и молекулярного анализа могут не совпадать в силу того, что молекулярные маркеры злокачественности появляются раньше морфологических изменений, соответствующих раку [11].

Заключение