Анализ межвидовых различий пяти видов землероек (Lipotyphla: Soricidae): морфометрические и молекулярные данные

М ногие представители семейства Землерой-ковые подразделены на ряд форм, отличающихся как по уровню, так и качеству различий, в связи с чем возникают проблемы в определении структурированности вида и его границ. Поэтому как отечественные, так и зарубежные исследователи все чаще обращают внимание на соотношение морфологической и генетической изменчивости, что, по мнению многих авторов, является одной из основных задач современной эволюционной биологии. Этому вопросу посвящено множество исследований, касающихся различных таксономических групп, результаты некоторых выявили значительную связь между уровнем молекулярных и морфологических различий [5, 8]. Другие исследователи не нашли такой зависимости [4].

Цель данной работы – оценка соотношения межвидовых морфологической (краниометрической) и генетической (изменчивость мтДНК) изменчивости пяти видов семейства Землеройко-вые: малой ( Sorex minutus Linnaeus, 1766), средней ( S. caecutiens Laxmann, 1788), равнозубой ( S. isodon Turov, 1924) и обыкновенной ( S. araneus Linnaeus, 1758) бурозубок и обыкновенной куто-ры ( Neomys fodiens (Pennant, 1771)).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для изучения межвидовых морфологических различий методом геометрической морфометрии проанализировано 46 черепов землероек (рис. 2): №№ образцов S. minutus : 14, 16, 24, 32, 34, 38, 40, 41 (место и год отлова: п. Пырский Котласского района Архангельской области, 2004); №№ образцов S. caecutiens : 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 42

(п. Приозерный Корткеросского района Республики Коми, 1999-2001); №№ образцов S. isodon : 11, 12, 44 (п. Пырский; с. Гам Усть-Вымского района Республики Коми, 2008 г.); №№ образцов S. araneus : 13, 15, 17, 18, 19, 20, 23, 25, 27, 28 (п. Пырский); №№ образцов Neomys fodiens : 21, 22, 26, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 39, 43, 45 (п. Пыр-ский). В качестве переменных использовали прокрустовы координаты (PrC), прокрустовы дистанции (PrD) и переменные формы (Relative Warps, RW). Каждую переменную рассчитывали стандартными методами [2, 10] с использованием программы MorphoJ. Анализировали оцифрованные (разрешение 2400 dpi) изображения латеральной стороны правой ветви нижней челюсти, полученные с помощью сканера Epson Perfection 3490 Photo. Форма каждого объекта (нижняя челюсть) была описана декартовыми координатами с использованием 16 меток (рис. 1).

Рис. 1. Метки на латеральной стороне нижней челюсти, используемые в исследовании

Для расстановки меток использовали программу tpsDig ver. 1.40. Кластерный анализ проводили в программном пакете PAST ver. 1.79. Соответствие между матрицей PrD и дендрограммой определяли по коэффициенту кофенетической корреляции.

Для проведения молекулярнофилогенетического анализа использовали последовательности cyt b мтДНК, взятые из базы данных GenBank (NCBI, USA) и полученные на базе ЦКП «Молекулярная биология» Института био- логии Коми НЦ УрО РАН. Выделение ДНК производили с помощью набора «FastDNASpinKit» («QBioGene», Канада) согласно инструкциям производителя. Выделенную ДНК хранили при температуре -20 °С. Амплификацию проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей 5 мкл ScreenMix («Евроген», Россия), 5 мкл каждого праймера (0.3 мкM), 9.0 мкл воды без нуклеаз («Ambion», США) и 1.0 мкл геномной ДНК (1100 нг). Для амплификации последовательности гена cyt b использовали общепринятые праймеры L14734 и H15985 [7]. Секвенирование проводили с использованием набора реагентов ABI PrismBigDyeTerminator v. 1.1 на приборе ABI PRISM 310 GeneticAnalyzer («Applied Biosystems», США). Выравнивание последовательностей проводили вручную и автоматически с помощью программы ClustalW, филогенетический анализ осуществляли в программном пакете MEGA 4.0 [9]. Оценку корреляции между матрицами генетических и прокрустовых дистанций проводили тестом Мантела [6].

РЕЗУЛЬТАТЫ

В связи с тем, что выборки пяти видов землероек могли быть неоднородны на видовом уровне, т.е. содержать животных, отловленных в разные годы, в нескольких смежных биотопах или локалитетах, мы протестировали каждую выборку на соответствие распределения значений CS модели нормального распределения (Normality test). Тест Шапиро-Уилка выявил для всех пяти выборок, соответствующих разным видам, нормальное распределение (Wmandible = 0.925–0.933, p> 0.05). Тест Левине по размеру (CS) и форме (RW), проведенный для всех выборок, показал их однородность (значимость теста p>0.05). Таким образом, дальнейший анализ проводился по 5 выборкам. Кластерный анализ на основе матрицы PrD без подразделения на выборки позволилразделить образцы на две группы (рис. 2).

Рис. 2. Результаты кластерного анализа (метод UPGMA) на основе матрицы прокрустовых дистанций нижней челюсти землероек.

В первую вошли образцы S. caecutiens, во вторую – образцы S. minutus, S. isodon, S. araneus, Neomys fodiens. Образцы второй группы по форме нижней челюсти объединились в подгруппы по видовой принадлежности, но абсолютной кластеризации по четырем видам не произошло, за исключением подгруппы в которую вошли образцы S. minutus. Значения коэффициента кофенетиче-ской корреляции для матрицы дистанций по нижней челюсти (r=0.88) удовлетворительно. Дискриминантный анализ пяти групп (видов) Землеройковых по нижней челюсти (PrC) выявил ста- тистически значимые различия между всеми группами (p<0.001).

Полученные данные позволили выявить необычный на первый взгляд статус обыкновенной куторы. А именно то, что кутора являющаяся представителем совсем иной трибы нежели остальные рассмотренные виды, относящиеся к роду Sorex , не образовала отдельный кластер на дендрограмме иллюстрирующей матрицу прокрустовых дистанций, а вошла в один кластер с равнозубой и обыкновенной бурозубками (рис. 2).

AB062732-Sorex caecutiens

AB062735-Sorex caecutiens

60 AB119181-Sorex caecutiens

AB062730-Sorex caecutiens

AB062734-Sorex caecutiens

AB062729-Sorex caecutiens

AB062731-Sorex caecutiens

AB062726-Sorex caecutiens

AB062728-Sorex caecutiens

AB062727-Sorex caecutiens

AB062733-Sorex caecutiens

100 GQ272518-Sorex minutus

GQ272517-Sorex minutus

GQ494308-Sorex minutus

GQ494311-Sorex minutus

GQ494307-Sorex minutus 63

GQ494309-Sorex minutus

GQ494310-Sorex minutus

32 GQ494305-Sorex minutus

67 GQ494306-Sorex minutus

AB028500-Sorex isodon

1 г AJ000438-Sorex isodon

99 AJ000437-Sorex isodon

AJ409867-Sorex araneus

AJ245893-Sorex araneus

AJ409879-Sorex araneus

AJ409880-Sorex araneus

AJ409871-Sorex araneus

2305 J

AJ409870-Sorex araneus

AJ409869-Sorex araneus

³⁶ AJ409881-Sorex araneus

⁸⁷ AJ409882-Sorex araneus

DQ991062-Neomys fodiens

DQ991063-Neomys fodiens

60 58	DQ991060-Neomys fodiens DQ991059-Neomys fodiens
42 100   82	AJ409868-Sorex araneus DQ991058-Neomys fodiens DQ991056-Neomys fodiens
53 8490	AB175096-Neomys fodiens 1— AB175097-Neomys fodiens AB175071-Neomys fodiens
58	AB175098-Neomys fodiens DQ991061-Neomys fodiens

GU981298-Neomys fodiens

GU981295-Neomys fodiens

Анализ молекулярно-филогенетических связей показал, что исследуемые образцы сгруппировались в пять кластеров, согласно их видовой принадлежности (рис. 3).

При этом видно, что образованное древо делится на два кластера соответствующих делению на трибы. В один кластер вошли представители трибы Neomyini – род Neomys , а во второй представители трибы Soricini – род Sorex . При детальном рассмотрении кластера, в который вошли представители рода Sorex можно заметить, что S. araneus является внешней группой по отношению к остальным видам, что опять же соответствует общепринятой классификации, в которой этот вид относиться к подроду Sorex , а остальные три вида относятся к подроду Homalurus , который в эволюционном ряду считается более продвинутым. Следуя выше сказанному, можно отметить, что на примере анализа исследуемых пяти видов представителей семейства Землеройковые, отчасти искусственная классическая система их классификации полностью соответствует системе построенной на основе молекулярных маркеров ( cyt b мтДНК).

Оценка корреляции между матрицами генетических и прокрустовых дистанций на основании теста Мантела, позволяет отметить, что связь между матрицами достоверно низкая (999 повторов; p-value: 0.001; коэффициент корреляции – 0.39). Другими словами, дифференциация рассматриваемых групп по генетическим маркерам (мтДНК) не полностью совпала с морфологической дифференциацией (форма нижней челюсти).

ВЫВОДЫ

Таким образом, исследование данной группы насекомоядных животных показало высокую роль адаптации в формировании краниометрических отличий. Сравнивая полученные данные с общепринятой таксономической классификацией, мы можем проследить их взаимосвязь только с дан- ными молекулярно-генетического анализа. Исходя из этого, для построения схемы филогенетических связей более достоверным будет использование молекулярно-генетических данных.

Коллектив авторов выражает благодарность сотруднику ФГБУН Зоологического института РАН г. Санкт-Петербург Л.Л. Войта за ценные рекомендации и консультацию в ходе выполнения данной работы.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 13-04-98823 и Правительства Республики Коми.